诱变获得植物突变体库

实验一　EMS诱变获得植物突变体库

【实验目的】

1.掌握利用EMS获得拟南芥突变体的原理和操作方法。

2.掌握拟南芥种植和管理的方法。

【实验原理】

甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)是一种可改变DNA结构的烷化剂，它与DNA中的磷酸嘌呤和嘧啶作用，使之产生突变。烷化剂具有一个或多个活性烷基，这些烷基能被转移到其他分子上置换氢原子，发生烷化作用。烷基化位点主要发生在G(鸟嘌呤)的N7位置上，N7烷基化后成为带一个正电荷的季胺基团。这个季胺基团可促进第一位氨基上氢解离，使G不再与C配对而是与T配对，从而造成G-C碱基对转换为A-T碱基对，引起点突变。利用这一原理获得的点突变是EMS诱变过程中获得最多的点突变类型。此外，还有少部分的G∶C对可以变为任何碱基对G∶C、C∶G、A∶T、T∶A，既有转换又有颠换。此外，EMS也可与核苷结构中的磷酸基反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸基与糖基之间切断，产生染色体的缺失。

EMS诱变技术的优点是突变频率高、容易获得饱和突变、筛选工作量少(1位点/2000～5000M2代植株);同时具有基因突变的多种效应，如功能完全缺失和部分缺失、功能的数量性变化以及功能的组成性表达等;可以获得双突变。缺点是需要利用图位克隆技术鉴定突变基因，并且需多次回交(一般5～10次)清除背景。

【实验材料】

拟南芥种子。

【实验器材】

500ml带盖子玻璃瓶。

【药品试剂】

0.2%～0.4% EMS溶液，1mol/L NaOH和双蒸水(ddH₂ O)。

【实验方法】

1.取50000～100000粒拟南芥种子(1～2g)在水中浸泡过夜。

2.用0.2%～0.4% EMS溶液浸泡种子10～20小时。

3.倒掉EMS溶液;用1mol/L NaOH处理残留EMS溶液。

4.用ddH₂ O清洗种子20次;此时拟南芥种子标记为M1代。

5.播种M1种子。

6.单株或混合株收获M2代种子用于突变体筛选。

【注意事项】

1.诱变剂都有程度不同的毒性，有的是潜在的致癌剂，因此在处理时避免与皮肤接触或吸入气体，一般多在具有通风管及密闭条件的超净台上戴乳胶手套进行操作。

2.影响诱变效果的因素包括:诱变剂的理化特性、被处理材料的遗传类型及生理状态、诱变剂的浓度和处理时间、处理的温度、诱变剂溶液pH值及缓冲液的作用。

3.用EMS处理种子之后，一定要用大量的水将残余在种子表面的EMS清洗干净。

【思考题】

1.EMS诱变获得植物突变体的原理。

2.利用EMS进行诱变时应注意的事项。