实验二十三转基因植株蛋白质水平的检测(

实验二十三　转基因植株蛋白质水平的检测(Western blot)

【实验目的】

1.掌握Western杂交的原理和基本操作方法。

2.掌握Western杂交的方法在植物发育研究领域的应用。

【实验原理】

Western免疫印迹(Western blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【实验器材】

蛋白质电泳装置，蛋白质转膜装置，电泳仪等。

【药品试剂】

1.SDS-PAGE试剂。

2.匀浆缓冲液: 1ml 1mol/L Tris-HCl(pH 6.8)，6ml 10% SDS，0.2mlβ-巯基乙醇，2.8ml ddH₂O。

3.转膜缓冲液: 2.9g甘氨酸，5.8g Tris，0.37g SDS，200ml甲醇，加ddH₂O定容至1000ml。

4.0.01mol/L PBS(pH7.4): 8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂ HPO₄，0.24g KH₂ PO₄，加ddH₂O定容至1000ml。

5.膜染色液: 0.2g考马斯亮蓝，80ml甲醇，2ml乙酸，118ml ddH₂ O。

6.封闭液(5%脱脂奶粉，现配): 1g脱脂奶粉溶于20m l的0.01mol/L PBS中。

7.显色液: 6mg DAB; 10ml0.01mol/L PBS; 0.1ml硫酸镍胺; 1μl H₂O₂。

【实验方法】

一、蛋白质样品提取

该方法是利用蛋白质提取试剂盒直接提取的方法。

1.冻存组织匀浆:预先将研钵置于－20℃或－70℃冰箱内冷冻。取液氮冻存的植物组织，放入冰冻的研钵内研磨至粉末状，注意使组织一直处于冰冻状态，如组织颜色加深或变黑通常表明组织已融化。将研磨好的组织转移到离心管，按比例加提取试剂(按每200mg植物组织加500μl)，混匀后冰上放置20分钟，其间可数次颠倒混匀，以便蛋白质溶解。

2.新鲜组织匀浆:取新鲜组织放入研钵中，按每200mg植物组织加500μl的比例加提取试剂，充分研磨使匀浆液中看不到大的块状或片状组织，保证组织研磨破碎。转移至离心管内，冰上放置20分钟。

3.12000r/min离心15分钟，弃去沉淀。蛋白质在上清液中，将上清液转移至新管。

4.将上清液直接与2×SDS样品缓冲液混合后上样，或－70℃冻存。

二、电泳

1.制备电泳凝胶。

2.SDS-PAGE的制备:参见生物化学相关实验书籍。

三、转移

1.电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡3次，每次5分钟。

2.膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10分钟。

3.转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、whatman滤纸、NC膜或者PVDF膜、凝胶、whatman滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡。接通电源，恒流1 mA/cm²，转移1.5小时。

4.转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测胶条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50秒后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，以与显色结果作对比。

四、免疫反应

1.用0.01mol/L PBS洗膜3次，每次5分钟。

2.加入封闭液，平稳摇动，室温放置2小时。

3.弃封闭液，用0.01mol/L PBS洗膜3次，每次5分钟。

4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01mol/L PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12小时以上。阴性对照是以1% BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5.弃一抗和1% BSA，用0.01mol/L PBS分别洗膜4次，每次5分钟。

6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01mol/L PBS稀释)，平稳摇动，室温放置2小时。

7.弃二抗，用0.01mol/L PBS洗膜4次，每次5分钟。

8.加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

【注意事项】

1.对于不同的蛋白质，一抗和二抗的稀释浓度、作用时间和反应温度需要经过预实验来确定。

2.显色液必须新鲜配制使用，最后加入H₂ O₂。

3.DAB有致癌的潜在可能，操作时要特别小心。

【思考题】

1.Western杂交方法的原理。

2.Western杂交方法在植物发育生物学研究中的应用。

附:提取植物蛋白的其他方法

1.根据样品重量，1g样品加入3.5ml提取液(300ml: 45ml 1mol/L Tris-HCl，pH8;甘油75ml; 6g聚乙烯吡咯烷酮)，根据材料不同适当增加提取液的量;提取液放在冰上备用。

2.把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3～4小时)。

3.用离心机离心8000r/min，40分钟，4℃条件下，或11100r/ min，20分钟，4℃。

4.提取上清液，样品制备完成。

这种方法针对SDS-PAGE垂直板电泳。

附:秧苗蛋白质样品的提取

按Davermal等(1986)的方法进行。

1.100mg材料剪碎后加入10mg PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml 10%三氯乙酸(丙酮配制，含10 mmol/L即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，－20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15分钟，弃上清液，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mmol/Lβ-巯基乙醇)，再于－20℃沉淀1小时，同上离心并弃上清液。如有必要则再用80%丙酮(含10mmol/Lβ-巯基乙醇)。所得沉淀低温冷冻，真空抽干。

2.按每毫克干粉加入20μl UKS液(9.5mol/L尿素，5mmol/L碳酸钾，1.25% SDS，0.5% DTT，2% Ampholine(Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5～10)，6% Triton X-100，37℃温育30分钟，其间搅动几次，28℃(温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰) 16000r/min离心15分钟，离心力大一点、时间长一点好。上清液即可上样电泳，或者－70℃保存。