杂交验证转基因植株中外源基因的拷贝数

杂交验证转基因植株中外源基因的拷贝数_植物发育生物学实

实验十八　Southern杂交验证转基因植株中外源基因的拷贝数

【实验目的】

通过本实验使学生了解Southern杂交的原理和步骤。

【实验原理】

Southern杂交用于证明外源DNA是否确实整合到转基因植株的基因组中，此技术不仅能检测外源DNA，而且也能推算出外源基因在染色体上的拷贝数。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。其步骤如下(图2-2):

图2-2　Southern杂交和Northern杂交的示意图

(转引自中山大学生命科学学院遗传学网络课程)

(1)提取DNA，酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。

(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。

(3)预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。

(4)让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。

(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。

Southern杂交能否检出杂交信号取决于许多因素，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后，Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1 pg用32 P标记的高比活性探针的(＞109 cpm/μg)互补DNA。

【实验材料】

烟草和拟南芥野生型植株及转基因植株。

【实验器材】

高速离心机，电泳仪，核酸凝胶电泳槽，紫外凝胶成像系统，FX分子成像系统等。

【药品试剂】

1.TE Buffer: 50mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，pH7.4。

2.3mol/L醋酸钠。

3.7.4mol/L醋酸铵。

4.70%(V/V)乙醇。

5.5mol/L醋酸钾。

6.提取液: 500mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA，0.38%(w/v) Sodium Bisulfate，1.25%( w/v) SDS，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，8.3mmol/L NaOH。

【实验方法】

一、植物基因组DNA的提取

1.取拟南芥叶片150mg，置于2ml的离心管中。

2.在离心管中倒入液氮，待挥发至原体积一半时，用小型研棒研磨，直至磨碎。

3.加入700μl预热(65℃)的提取液，用牙签混匀。

4.将混合液在65℃水浴中温浴10分钟。

5.加入220μl 5mol/L的醋酸钾并混匀。

6.将混合液在冰上放置20～40分钟，4℃，12000r/min离心3分钟，转移上清液至一新的离心管。

7.加入0.7倍体积预冷的异丙醇，混匀，4℃放置3分钟以加速沉淀。4℃，12000r/min离心3分钟。

8.弃上清液，向沉淀中加入等体积预冷的70%乙醇并混匀。4℃，12000r/min离心3分钟。

9.重复第8步操作。

10.将所得沉淀在空气中干燥一会儿。

11.加入300μl TE Buffer涡旋振荡2秒钟。

12. 65℃下放置5分钟，涡旋振荡2秒钟。

13.加入150μl 7.4mol/L醋酸铵，轻轻摇匀，5000r/min离心沉淀杂质。

14.将上清液平均转移到1.5ml的离心管中，加入330μl异丙醇，混匀。

15.12000g离心8分钟沉淀DNA。用70%乙醇洗涤，晾干或真空干燥。

16.分别加入25μl TE Buffer，4℃溶解沉淀过夜。

17.65℃下放置5分钟，涡旋2秒，－20℃保存。

二、基因组DNA的限制酶切

【注意事项】

根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10～30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2～4U的酶消化1μg的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg/μl为宜。由于内切酶保存在50%甘油内，而酶只有在甘油浓度＜5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

1.按照表2-2在1.5ml离心管中依次加入基因组DNA、10×酶切缓冲液和限制性内切酶，在最适温度下消化1～3小时。

表2-2　基因组DNA的限制性酶切

2.消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，但不超过6小时。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。

3.消化后的DNA加入1/10体积的0.5mol/L EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提，等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解(参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA丢失)。

【注意事项】

如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件一致时，则两种酶可同时进行消化;如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。

三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

1.制备0.8%凝胶:一般用于Southern杂交的电泳胶为0.8%。

2.电泳:电泳样品中加入6×Loading缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。

1～2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。

四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物

【注意事项】

转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维膜(NC膜)或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法(又称为毛细管法)。

1.试剂准备:

变性液: 0.5mol/L NaOH; 1.5mol/L NaCl;

中和液: 1mol/L Tris-HCl(pH 7.4); 1.5mol/L NaCl;

转移液(20×SSC): 175.3g NaCl，82.2g柠檬酸三钠，用NaOH将pH值调至7，加ddH₂ O定容至1000m l。

2.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30分钟。

3.中和:将凝胶转移到中和液15分钟。

4.转移:按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5分钟。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3～5张滤纸和大量的纸巾备用。按照图2-2顺序进行摆放。转移过程一般需要8～24小时，每隔数小时换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。

5.转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数分钟，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80℃烘2小时，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

五、探针标记

【注意事项】

进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好;地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于α-³² P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。

探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤。

1.取25～50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5分钟，立即置冰浴中。

2.在另一个0.5ml离心管中按照表2-3加入各种成分。

表2-3　Southern杂交中探针标记的反应体系

3.将变性模板DNA加入到上管中，加ddH₂ O至50μl，混匀。室温或37℃反应1小时。

4.加50μl终止缓冲液终止反应。

六、杂交

【注意事项】

Southern杂交一般采取液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液(杂交液)中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断在膜上流动。杂交液可以自制或购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方: PEG 6000 10%; SDS 0.5%; 6×SSC; 50%甲酰胺。杂交液的杂交温度为42℃。

1.预杂交

NC膜浸入2×SSC中5分钟，在杂交瓶中加入杂交液(8cm×8cm的膜加入5ml即可)，将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升温到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA(已溶解在水或TE中) 100℃加热变性5分钟，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4小时。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景，提高杂交特异性。

2.杂交

倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5分钟，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。

七、洗膜

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5分钟，然后按照下列条件洗膜:

2×SSC/0.1% SDS，42℃，10分钟;

1×SSC/0.1% SDS，42℃，10分钟;

0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10分钟;

0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10分钟;

0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10分钟。

【注意事项】

在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1～2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。

八、检测

1.洗完的膜浸入2×SSC中2分钟，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。

2.将膜正面向上，放入暗盒中(加双侧增感屏)，在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置－70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1～3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。目前有条件的实验室均采用自动化的磷屏成像系统，减少了洗X光胶片的步骤。

【注意事项】

1.为了获得良好的转移和杂交效果，应根据DNA分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段(大于15kb)，可在变性前用0.2mol/L HCl预处理10分钟使其脱嘌呤。

2.转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果;不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。

3.转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率。同时，注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。

4.注意同位素的安全使用。

5.影响Southern杂交实验的因素很多，主要有DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

【思考题】

1.Southern杂交的原理及基本步骤。

2.影响Southern杂交的因素有哪些? Southern杂交实验中有何注意事项?