转基因动物的检测方法

三、转基因动物的检测方法

转基因动物的基因组是否带有外源基因可以通过PCR反应进行快速筛选，并进一步用southern blotting确证，阳性转基因个体可进一步检测表达产物、表达量以及可能的生物学活性。

（一）基因重组子构件功能的检测

转基因动物所用基因重组子是否能够特异表达以及表达水平的高低可以事先在体外或体内进行验证。

体外验证可以通过组织特异分泌表达的特点进行，如在制备乳腺特异表达的生物反应器转基因动物前，先将外源基因转染原代培养的乳腺细胞，合适条件下乳腺细胞应该表达和分泌外源蛋白，如此即可验证构建的基因重组子表达载体的功能，以减少不必要的人力、物力和财力的浪费。

体内方法可以直接将构建好的基因重组子用注射器或基因枪注入到乳腺组织中，也可以通过血管或尾静脉注射动物，定时按照设计要求采集乳汁、血样、尿样或精液等用来检测外源基因的表达情况及表达水平，以确定构建的重组子构件的功能是否按照设计的功能进行。体内检测还可以通过诱导泌乳或诱导性早熟等手段对阳性转基因动物进行处理，使乳腺或性腺等提前发育，通过诱导分泌的乳汁或诱导早熟的精液检测外源基因的表达，可以提前检测到转基因动物是否按照设计的方案表达外源基因，以减少昂贵的动物饲养费用。

（二）外源基因整合的检测

从“转基因”动物细胞或组织取样，抽提基因组DNA，利用外源基因的特异PCR引物进行快速PCR检测，PCR阳性的动物再从基因组DNA进行Southern杂交印迹分析，阳性杂交结果基本可以认为是整合了外源基因的转基因动物。

（三）基因表达的检测

外源基因的表达与否可以在RNA和蛋白质两个水平上进行检测，RNA水平的检测，抽提转基因动物特定组织或细胞的mRNA，通过Northern印迹方法或RT－PCR方法检测外源基因在转基因动物体内是否发生了转录。蛋白质水平则可以通过检测特定组织或细胞中是否有外源基因的表达产物，常用的方法包括Western blotting、ELISA或放射免疫测定，高表达的基因产物还可以通过SDS－PAGE进行检测甚至定量。

（四）应用报告基因

从实验研究的角度，为了检测的直观和方便，外源基因通常采用报告基因来代替目的基因，这对于研究一个技术平台是非常有用的。常用的报告基因包括：β^－半乳糖苷酶基因（β^－gal）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因等。近年来开发和广泛使用的绿色荧光蛋白基因是一个被广为采用的报告基因，绿色荧光蛋白（GFP）是水母中分离到的一种蛋白质（238个氨基酸残基，分子量30×10³），活体GFP与离体GFP一样，在蓝光的激发下能产生绿色荧光，可以用紫外、荧光分光光度计或荧光显微镜进行活体观测，被广泛用于原核和真核生物转基因的报告基因。