质粒大量提取溶液混匀的轻柔程度

实验三　质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

【实验目的】

1．掌握质粒DNA的碱裂解法提取操作步骤与原理。

2．掌握质粒DNA的纯化步骤及原理。

【实验原理】

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1 kb至200 kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，采用合适的条件可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清液中;蛋白质与染色体DNA不可逆变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

【实验器材】

恒温水浴培养箱、摇床、低温超速离心机、水浴锅、冰水浴、电泳仪、稳压电源、电炉、乳胶手套、紫外投射仪、照相装置等。

【药品试剂】

1．溶液Ⅰ:50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8)，10 mmol/L EDTA(pH8)。取1 mol/L Tris-HCl(pH 8)12．5 ml，0．5 mol/L EDTA(pH8)10 ml，葡萄糖4．73 g，加蒸馏水至500 ml。在10l bf/in²(6．895×10⁴Pa)高压灭菌15分钟，储存于4℃。

2．溶液Ⅱ:0．2 mol/L NaOH，1%SDS。取2 mol/L NaOH1 ml，10%SDS 1 ml，加蒸馏水至10 ml。使用前临时配置。

3．溶液Ⅲ:醋酸钾缓冲液(pH4．8):取5 mol/L醋酸钾300 ml，冰醋酸57．5 ml，加蒸馏水至500 ml。4℃保存备用。

4．TE:10 mmol/L Tris-HCl(pH8)，1 mmol/L EDTA(pH8)。取1 mol/L Tris-HCl(pH8)1 ml，0．5 mol/L EDTA(pH8)0．2 ml，加蒸馏水至100 ml。15l bf/in²高压湿热灭菌20分钟，4℃保存备用。

5．苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)。

6．无水乙醇和70%乙醇。

7．5×TBE:Tris碱54 g，硼酸27．5 g，EDTA-Na₂·2H₂O4．65 g，加蒸馏水至1000 ml。15l bf/in²高压湿热灭菌20分钟，4℃保存备用。使用低浓度的TBE时加水稀释即可。

8．10 mg/ml溴化乙锭(EB):带好乳胶手套，称取100 mg EB，加入10 ml水，磁力搅拌数小时，使充分溶解，转移至棕色瓶内，4℃保存备用。

9．RNaseA(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free)的RNaseA 10 mg/ml，TE配制，沸水加热15分钟，分装后储存于－20℃。

10．6×loading buffer(上样缓冲液):0．25%溴酚蓝，0．25%二甲苯青FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。

11．1%琼脂糖凝胶:称取1 g琼脂糖于三角烧瓶中，加100 ml 0.5×TBE，电炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液(10 mg/mL)至终浓度0．5μg/ml(注意:EB为强诱变剂，操作时戴手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30分钟以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0．5×TBE)，即可上样。

【实验方法】

1．挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养过夜(约12～14小时)。

2．取1．5 ml培养物入微量离心管中，室温条件下8000 r/min离心1分钟，弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3．将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4．加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2～3分钟，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清亮)。

5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3～5分钟。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K⁺使SDS-蛋白复合物沉淀。

6．加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇混合物，振荡混匀，4℃条件下，12000 r/min离心10分钟。

7．小心移出上清液于一新微量离心管中，加入2．5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2～5分钟，4℃条件下，12000 r/min离心15分钟。

8．1 ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1～2次，4℃条件下，10000 r/min离心5分钟，弃上清液，将沉淀在室温下晾干。

9．沉淀溶于20μl TE(含RNaseA20μg/ml)，37℃水浴30分钟以降解RNA分子，－20℃保存备用。

10．取制备的质粒DNA 1～2μl，加适当loading buffer混匀上样，采用1～5 V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片，保存试验照片。

【注意事项】

1．本裂解法小量制备质粒DNA重复性好。若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

2．加入溶液I后要充分悬浮。

3．加入溶液Ⅱ后要轻轻地颠倒混匀。

4．酚/氯仿抽提后小心吸取上清液。

【思考题】

1．质粒DNA的提取方法有哪几种，各有何特点?

2．在生化领域，质粒DNA的提取目的是什么?