质粒和噬菌体

第一章　大肠杆菌、质粒和噬菌体

引　言

大肠杆菌、质粒和噬菌体均是分子生物学研究尤其是分子克隆常用的重要工具，分子生物学发展过程中的许多重大发现、重要的结论和新概念都是通过对细菌、噬菌体的研究获得的，如DNA是遗传物质的证实、分子基因新概念的得出、遗传重组机制证明、基因表达调控模型的建立等。现代基因工程技术的建立和快速发展也是建立在工具酶、载体和受体系统研究的基础上。质粒和噬菌体一般用作将DNA引入细胞的载体，而大肠杆菌则用来作为质粒和噬菌体扩增的宿主，本章将介绍它们的一些生物学特性与操作方法。

大肠杆菌是一种棒状细菌，属原核生物，其染色体为4638858bp的环状染色体。大肠杆菌对生长条件要求不高，在仅含有简单碳水化合物(如葡萄糖，提供碳源和能量)的培养基中就能生长，在仅提供氮、磷和微量元素的无机盐基本培养基上也能快速生长。如果用丰富培养基(含氨基酸、核苷酸前体、维生素以及其他一些细菌不能合成的代谢成分等)来培养，那么大肠杆菌将生长得更为迅速。

在液体培养基中培养时，大肠杆菌先进入一个生长滞后期，然后才开始裂殖。如果用丰富培养基培养，大肠杆菌复制一代仅需20～30分钟，这种指数生长相称为对数期。随着细菌的生长，培养基中的营养成分和氧被耗尽，而培养基中逐渐增加的代谢产物也可抑制细菌的快速生长，此时菌体密度就会处于一种比较恒定的状态，这就是细菌生长的饱和期。培养基中细菌密度刚到达这一恒定状态时称为新鲜饱和期。一般在这一时相细菌的密度为1×10⁹～2×10⁹/mL，此时细胞迅速分裂停止。DNA重组技术中常用的细菌一般都是20世纪60年代发展起来的大肠杆菌K-12株的衍生菌株。对这一菌株以及以此为宿主菌的噬菌体和质粒所进行的研究为分子生物学的进展奠定了良好的基础。

在天然的大肠杆菌中含有一些独立于染色体外的环状DNA分子，称为质粒。它们能自主复制，具有抗生素抗性和产生限制酶等重要的生物学功能。20世纪70年代以来，研究人员在实验室里利用天然质粒中这些具有特殊作用的DNA片段，人工构建了许多衍生质粒，而后者已成为DNA重组中最常用的载体，可将DNA引入细胞。一般而言，用作克隆的质粒应具备以下条件:自主复制功能、可以共选择的遗传标记、多个限制性内切酶的单一切点(克隆位点)、载体本身要尽量小和对载体本身的遗传背景要充分了解。在对质粒进行分析和操作前必须分离获得一定纯度的质粒DNA。如需从大量克隆中快速制备和分析质粒DNA，可以通过快捷的小量制备法(冷碱法)获得。如分离大量高纯度的DNA，可使用氯化铯密度梯度超离心方法。制备好的质粒还需导入到大肠杆菌中才能使其扩增，一般先制备感受态的大肠杆菌，通过氯化钙转化法或电穿孔法可将质粒DNA导入。实验室常用的氯化钙法即可获得较好的转化效率，操作简单，无需特殊仪器。如果需要特别高的转化效率，应采用电穿孔法，此法需要专门的电穿孔设备，但简单、快速、可靠。

另一种常用的载体就是噬菌体，实验室采用的多为一种丝状噬菌体的衍生体——M13mp载体。插入该载体的DNA能以单链环状DNA和双链环状DNA两种形式存在，因而被广泛应用。外源DNA被插入双链DNA中后，转化细菌细胞，一旦这种DNA进入细胞内，双链DNA即进行复制，合成新的双链DNA和源于载体双链中某一条链的单链环状DNA，单链环状DNA被包装进入噬菌体颗粒中，并在不裂解细胞的情况下释放到培养液中。离心被感染细胞培养液得到的上清液有很多只含单链DNA的噬菌体颗粒。单链DNA的获得为DNA序列测定和基因诱变提供了新方法。

为了便于学习，对于常见的一些名词及用语，简介如下:

α片段(alpha fragment):含β-半乳糖苷酶氨基末端的肽链，lacZ基因的产物。α片段缺少酶的活性，但能够与ω片段(见下文)一起形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。

α互补(alpha-complementation):ω片段通过与α片段联合起来而使β-半乳糖苷酶活性得以恢复。

ω片段(omegafragment):含β-半乳糖苷酶羰基末端片段的蛋白质。该蛋白质缺乏酶的活性，但当肽链与一α片段结合后，β-半乳糖苷酶的活性就能被恢复。

cos:λ噬菌体ter功能的作用位点。cos位点被ter切割，产生两个黏性末端(cos末端)。

par:一些质粒上的位点，其作用为确保每一个子代细胞能得到一个质粒拷贝。

F因子(F factor):在细菌细胞内的环状DNA质粒，可独立存在或整合到细菌染色体中，起决定细菌性别的作用，又称为性因子(sex factor)。它是在大肠杆菌和有关物种中发现的遗传单元。编码用于性纤毛形成的蛋白，该纤毛允许F因子在细菌之间转移。

SOS反应(sos response):大肠杆菌对DNA的损伤或抑制DNA复制的其他作用的反应。在该反应中，λ衍生噬菌体被诱导。

饱和培养物(saturated culture):因为营养物的耗竭或废物的堆积，细胞停止生长的液体细胞培养物。

标记(marker):在同一种群中一个机体与另一机体(常指野生型)之间可检测的遗传差异。

不相容(incompatible):两个质粒不能在同一个细胞中永远没有选择地复制的现象。

不相容组(incompatible group):不能共存于同一个细胞中的一组质粒。

包装抽提物(packaging extract):从含有λ噬菌体头部、尾部及包装蛋白的特殊大肠杆菌菌株中得到的提取物。将噬菌体DNA加入到这种提取物中，可以装配成噬菌体颗粒。

雌性菌株(female strain):不含F因子并且当与含有F因子的菌株相遇时接受遗传信息的菌株。

带动转移(mobillzation):由可移动遗传成分如F因子引起DNA从一细胞到另一细胞的转移。

多接头(polylinker):含有连续的许多限制酶切位点的DNA片段称为多接头，也叫多克隆位点。

低拷贝数质粒(low-copy-number plasmid):当细胞在丰富培养基中生长时，每个细胞中拷贝数不超过20个质粒。

对数晚期(late log period):培养物指数生长的后期，在这之后，由于营养物耗尽和(或)废物的积累，生长放慢，进而完全停滞的阶段。

对数相(log phase):单细胞在培养过程中，细胞数目呈指数生长的时期。

丰富培养基(rich medium):含有复杂有机分子(多肽、核苷等)的生长介质。典型的成分包括胰蛋白胨(小牛)和酵母浸出液。

辅助噬菌体(helper phage):编码必需蛋白质并使得其他不编码这些蛋白质的噬菌体能够生长的噬菌体。

复制型(replicative form):单链RNA病毒和单链DNA病毒在复制过程中出现的双链核酸分子。

复制子(replicator):能独立进行复制的一部分DNA分子。它包括一个开始复制的位点(称复制区或复制原点)和复制终止点。

滚环复制(rolling circular replication):环状DNA分子采取的一种复制方式，这时DNA聚合酶连续环绕模板复制出现新的环状DNA分子。其步骤是:①负链保留为封闭式环状;②正链裂开，并继续沿环状负链模板延伸，同时以新形式的3'羟基末端作为DNA聚合酶的起始点;③原有的正链以某一单链尾部，从滚环中脱出;④接着新的负链开始，并在正单链尾端进行聚合;⑤在新的负链形成之前，复制中间体分裂为滚环的环状部分和线性部分。

感染复数(multiplicity of infection，MOI):感染的噬菌体与宿主细胞的比率。

感受态(competent):细菌或酵母细胞能够转变成有效摄入外来DNA的状态(例如，用氯化钙处理的大肠杆菌)。

过夜培养物(over night culture):小量的细菌经过过夜(6h以上)的培养，得到新鲜饱和的细菌液体培养物。

菌苔(lawn):覆盖平板表面的均一细菌层。

基本培养基(minimal medium):仅含有盐、维生素、微量元素和提供碳、氮、磷源的简单化合物的细胞生长培养基。

接种(inoculation):①将微生物，或某些活细胞移植到适于它生长繁殖的人工培养基或活的生物体内或体外(如动物体或组织培养)的方法，一般都须在无菌条件下进行;②将疫苗等注射到人或动物体内，以预防某些疾病。

克隆位点(cloning site):在载体上插入外源DNA的位点。

扩增(amplification):①一些质粒的拷贝数增加的过程，而这时宿主蛋白的合成是被抑制的;②对完整基因组而言，细胞内某(些)基因单独复制产生多个拷贝;③基因文库成批地大量复制。

平板(plate):指培养皿中固体培养基所形成的平面。用于培养单个的细菌克隆或噬菌体空斑。该词有时指96孔微量滴定板。

平板接种效率(efficiency of plating，EOP):在一些实验条件下细菌克隆或噬菌体空斑的滴度与通过生长在一些参照基质上得到的细菌或噬菌体滴度的比值。

原点(ori，origen):在基因组上DNA复制开始的位点。

溶原菌(lysogen):一种溶原性细菌细胞，也就是细胞中含有以原噬菌体状态存在着温和噬菌体的细菌。

松弛DNA(relaxed DNA):呈非超螺旋状态的环状DNA分子。

松弛控制(relaxed control):适用于不依赖于菌体细胞周期的复制的质粒。

松弛质粒(relaxed plasmid):指不受细菌细胞内染色体复制所控制的质粒。

生长晕(outgrowth):在组织块原代培养时，待组织块牢固附于瓶底后，再将瓶轻轻翻正，并继续培养，经一定时间后细胞自组织块边缘分散出来称生长晕。

涂板(plating out):将细菌或噬菌体在平板上铺开，使克隆或空斑得以形成。

温和噬菌体(temperate phage):指感染细菌后能够呈溶原性生长的噬菌体。

卫星菌落(satellite colony):在选择性培养板上，环绕大菌落生长的小菌落。这些菌落一般由在选择培养基上不能生长的菌落组成，但因为大菌落中的细胞中和了选择性成分，所以它们才得以在大的菌落附近生长。

先导蛋白(pilot protein):在丝状噬菌体被膜上用来帮助其进入细胞的蛋白质。

雄性株(male strain):含有F因子的菌株。

雄性专一性噬菌体(male-specific phage):因为吸附到性纤毛上，仅在雄性菌株中生长的噬菌体。

延迟期(lag period):指培养物在刚接种后，细胞还没有开始呈指数生长前的一段时期。

诱导(induction):在遗传学上指由于某一诱导物的作用使有关的基因合成特定的酶(见诱导系统)。

诱导系统(induction system):一种调节系统。在基因转录的调节过程中，调节基因(regulator gene)产生阻遏物(repressor)，阻遏物抑制了操纵子(operon)的转录作用。如果这时有诱导物(inducer)，也就是效应物(effector)与阻遏物结合，解除了阻遏物对操纵子的抑制，操纵子上的有关结构基因(structure gene)即转录。因此，在此情况下，转录过程只能在有效应物分子存在时才能进行，它起的作用称为诱导。

严紧型控制(stringent control):适用于复制与大肠杆菌细胞周期同步的质粒。

严紧型质粒(stringent plasmid):指质粒的自主复制受细菌染色体复制功能所控制，每个细菌里可含1～3个拷贝。

原噬菌体(prophage):休眠噬菌体，常整合在宿主染色质上，并随宿主菌一起复制。

转化(transformation):将DNA导入大肠杆菌或酵母细胞，并稳定地整合于基因组中，从而使受体细胞发生永生化改变的现象。过去也习惯于指正常细胞受致癌病毒感染发生癌变(永生化，失去接触抑制)的过程。

转染(transfection):病毒DNA或RNA导入感受态大肠杆菌中的过程。也指将任何DNA(包括质粒DNA)或RNA导入受体细胞的过程。

早期对数生长相(early log phase):在培养物生长过程中延迟期以后的时期。在该生长期间，细胞开始呈指数生长。

指数期(exponential phase):指细胞在液体培养基中培养，细胞数目呈指数增加的时期。

指数生长(exponential growth):培养物中细胞生长数量按时间的指数方程式而增长，并且在这段时期细胞的生长都是与当时存在的细胞数目呈正比例。即细胞数=ke^t。

指数生长速率常数(exponential growth rate constant):细胞繁殖世代的倒数，以每小时繁殖的世代数目来表示。