腐植酸对草甘膦抑菌性的体外中和作用

腐植酸对草甘膦抑菌性的体外中和作用

Awad A.Shehata1,2,3　Manfred Kühnert4　Svent Haufe4　Monika Krüger1　著

朱福军5,6　吴钦泉5,6　陈士更5，6　吴凤林5,6　丁方军5,6,7*　译

(1　德国莱比锡大学兽医系细菌和真菌研究所　莱比锡　04103

2　德国莱比锡大学Albrecht Daniel Thaer农学院　莱比锡　04159

3　埃及萨达特城市大学兽医学院禽和兔疾病系　萨达特　999060

4　德国魏恩伯拉WHPharmawerk股份有限公司　魏恩伯拉　01689

5　山东农大肥业科技有限公司　泰安　271000

6　山东省腐植酸高效利用工程技术研究中心　泰安　271000

7　山东农业大学资源与环境学院　泰安　271018)

摘　要：本文研究了不同浓度腐植酸对草甘膦抑菌作用的中和能力，测定了不同浓度腐植酸(0.25,0.5和1.0　mg/mL)在与不在下的草甘膦对不同细菌，例如栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、青春型双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和尼氏大肠杆菌(E.coli 1917 strain Nissle)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的最低抑菌浓度。研究结果表明，腐植酸显著缓解了草甘膦对不同细菌的抑菌作用，可有效缓解饲料和水体中草甘膦残留物的负面影响。

关键词：草甘膦　腐植酸　微生物区　抗菌剂

Neutralization of the Antimicrobial Effect of Glyphosate by Humic Acid in Vitro

Awad A.Shehata1,2,3,Manfred Kühnert4,Svent Haufe4,Monika Krüger1　write

Zhu fujun5,6,Wu qinquan5,6,Chen shigeng5,6,Wu fenglin5,6,Ding fangjun5,6,7*　translate

(1 Institute of Bacteriology and Mycology,Faculty of Veterinary Medicine,Leipzig University,Leipzig,04103

2 Albrecht Daniel Thaer-Institute of Agronomy at the University Leipzig,Leipzig,04159

3 Avian and Rabbit Diseases Department,Faculty of Veterinary Medicine,Sadat City University,Sadat,999060

4WHPharmawerkWeinböhla GmbH,Weinböhla,01689

5 Shandong Agricultural University Fertilizer Science &Technology Co.,Ltd.,Tai’an,271000

6 Engineering &Technology Research Center of High Efficient Utilization of Humic Acid of Shandong Province,

Tai’an,271000

7 College of Resources and Environment,Shandong Agricultural University,Tai’an,271018)

Abstract: In the present study,the neutralization ability of the antimicrobial effect of glyphosate by different humic acids was investigated.The minimal inhibitory concentrations of glyphosate for different bacteria such as Bacillus badius,Bifidobacterium adolescentis,Escherichia coli,E.coli 1917 strain Nissle,Enterococcus faecalis,Enterococcus faecium,Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium were determined in the presence or absence of different concentrations of humic acid (0.25,0.5 and 1.0　mg/mL).Our findings indicated that humic acids inhibited the antimicrobial effect of glyphosate on different bacteria.This information can help overcome the negative impact of glyphosate residues infeed and water.

[收稿日期]2015-09-30

[译者简介]朱福军，男，1990年生，助理工程师。主要研究方向：肥料应用技术研究。*通讯作者：丁方军，男，教授。E-mail：sdndfyjs@163.com。

Key words: glyphosate;humic acids;microbiota;antimicrobial

草甘膦[N-(膦酸甲基)甘氨酸]是一种高效除草剂，可有效抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl shikimate 3-phosphate synthase，EPSPS)和控制高等植物、藻类、细菌及真菌中芳香族氨基化合物的合成酶。草甘膦的除草功能是通过螯合锰来减少EPSPS的辅助因子黄素单核苷酸(FMN)。草甘膦与其代谢物氨基甲基膦酸酯(amino methyl phosphonate，AMPA)已在绿色未成熟的种子，收获的种子和地下水中被发现。草甘膦残留物根据国家的不同而不同(在某些国家草甘膦已失控)，甚至在一个国家里草甘膦的应用数量和频率都不加控制。作物干燥收获前施用草甘膦亦会导致食物来源中其残留量的升高。草磷酸每日最大允许摄入量(maximum daily intake，MDI)取决于口粮成分和口粮中每一被污染组分的百分比。此外，草甘膦在转基因大豆种植区水样中也被发现，其浓度在0.10～0.70mg/L之间。在德国的一些家禽和饲料样品中，草甘膦也被检出，其含量为0.4～0.9mg/kg(数据尚未发表)。学者们对草甘膦除草剂的安全性是存在争议的。一些报告认为，由于EPSPS在动物中并不存在，草甘膦的使用不会对人和动物的健康产生显著危害。然而，有研究指出，草甘膦仍可通过其他途径危害人和动物的健康，例如对细胞色素P450芳香化酶的抑制。

相关研究已证实，脊椎动物中的草甘膦是具有遗传毒性的，可致畸、对细胞产生毒害和最终导致细胞凋亡。草甘膦可在非常低的，低于农业稀释水平下对人类胎盘、胚肾、肝细胞系产生细胞毒害。草甘膦诱导体外成熟大鼠睾丸细胞的坏死和凋亡，并显著降低睾丸酮素到低浓度(1 ppm)。最近有学者提出，草甘膦可能是德国过去10～15年来牛肉毒梭状芽胞杆菌感染危险增加的重要因素。草甘膦对肠球菌属(Enterococcus spp.)的毒性可引起肠粘膜上的菌群失衡，导致梭菌属(Clostridium spp.)的过度生长，这是因为正常有益菌肠球菌属可抑制梭菌属的生长繁殖。

腐植酸被归类为多价的弱有机酸，具有化学形成复合物的能力。目前，利用腐植酸及其钠盐对农场中动物进行口腔治疗已得到许可。虽然诸多研究表明，草甘膦可被腐植酸吸收，然而有关腐植酸对草甘膦抑菌性影响的研究未见报道。因此，本研究将对腐植酸对草甘膦抑菌性的体外中和能力进行研究。

1　材料与方法

1.1　指示微生物

本研究利用以下细菌作为指示微生物：栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、青春型双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、尼氏大肠杆菌(E.coli 1917 strain Nissle)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。培养条件和菌株来源参见表1。

1.2　最低抑菌浓度

根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)相关标准测定草甘膦对这些病原菌的最低抑菌浓度(MIC)。在24孔微孔板中对草甘膦产生杀菌或抑制细菌繁殖效果的最低浓度进行测定。在肉汤培养基中对草甘膦进行系列稀释(10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，0.075mg/mL)，之后向微孔板内接种细菌(105　CFU/mL)，然后37℃恒温培养。草甘膦对细菌的最低抑菌浓度通过细菌在琼脂培养基生长的定量分析来最终计算(表1)。

1.3　利用腐植酸中和草甘膦对细菌的抑制活性

在1mg/mL各腐植酸(WH67/1，WH67/2，WH67/3，WH67/4，WH67/5，WH67/6.1，WH67/6.2，WH67/7，WH67/8.1，WH67/8.2及WH67/9)(德国魏恩伯拉WHPharmawerk股份有限公司)存在下，测定草甘膦(10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，0.075mg/mL)对粪肠球菌、栗褐芽孢杆菌、青春型双歧杆菌的最小抑菌浓度。在不同草甘膦浓度(10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，0.075mg/mL)存在下，对栗褐芽孢杆菌、青春型双歧杆菌、大肠杆菌、尼氏大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌生长影响最有效的是1mg的腐植酸WH67/4，草甘膦浓度为0.5和0.25mg/mL。

表1　草磷酸试验中使用的目标菌株、菌株来源和培养基质
Tab.1 Target strains used,their origin and medium used for glyphosate experiments

注：a　血琼脂(德国Fluka公司)；
　b　RCM：增强型梭菌属培养基(德国SIFIN公司)；
　c　MRS：乳酸菌琼脂(德国Oxoid公司)；
　d　CATC：柠檬酸-吐温-碳酸盐琼脂(德国Oxoid公司)；
　e　Caso琼脂(3.5%大豆酪蛋白，0.3%酵母提取物，0.1%葡萄糖，1.5%琼脂)。

2　结果与讨论

草甘膦对粪肠球菌、青春型双歧杆菌和栗褐芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.3mg/mL，0.3mg/mL和0.15mg/mL。腐植酸可以通过不同方式中和草甘膦的抑菌性。其中，浓度为1mg/mL的腐植酸WH67/2、WH67/3和WH67/4对草甘膦抑菌性的中和作用最强。在腐植酸WH67/2、WH67/3和WH67/4(1mg/mL)存在下，草甘膦对粪肠球菌、青春型双歧杆菌和栗褐芽孢杆菌的最低抑菌浓度菌大于2.4　mg/mL。其他腐植酸的中和活性相对较低，在这些腐植酸存在下，草甘膦对以上3种细菌的最低抑菌浓度介于0.3～0.6mg/mL之间。以上结果表明，腐植酸物质对草甘膦的吸附能力会因其大分子结构的不同而存在较大差异，此结果与先前的研究结果一致，即腐植酸可吸附草甘膦且可形成相对稳定的复合物。

腐植酸WH67/4中和草甘膦对栗褐芽孢杆菌、青春型双歧杆菌、大肠杆菌、尼氏大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌的抑制作用，呈现出剂量依赖性(图1)。甚至在低浓度(0.25mg/mL)的腐植酸WH67/4下，对草甘膦敏感的肠球菌、双歧杆菌和栗褐芽孢杆菌依然可在含0.6 mg草甘膦培养基中生长良好(图1)。与之相反，在1mg/mL浓度时，腐植酸WH67/4未能中和草甘膦对沙门氏菌的抑制作用。此外，腐植酸对高浓度草甘膦并无中和作用，原因是高浓度草甘膦并不具有生物相关性，其量已超过了饲料和环境中草甘膦预期含量的许多倍。值得一提的是，当草甘膦浓度较农业生产中检出的低时，其对微生物生长有抑制作用和抗生素效果。由于微生物群间的敏感性差异，草甘膦可对细菌群落产生干扰。导致生物体产生响应的任何环境改变可被视为是一种胁迫。在生物学中观测到的生物胁迫被认为是一种全球现象，这种现象可扩展到人为压力，例如基因工程或异型生物质(包括草甘膦)污染。通过腐植酸使肠球菌和双歧杆菌免受草甘膦残留物的危害可降低草甘膦诱导的菌落失调和降低感染肉毒菌的风险，因为已有研究证实肠球菌对梭状芽孢杆菌具有拮抗作用。双歧杆菌对草甘膦是敏感的，被认为可创造出如沙门氏菌等致病菌的不利条件。所测试的腐植酸并未对所试细菌生长产生直接的显著影响(图1)。

图1　腐植酸WH67/4对草甘膦抑菌作用的中和
Fig.1 Neutralization of the antimicrobial effect of glyphosate to different bacteria withWH67/4 humic acid (HA)

注：每毫升细菌数为log10　CFU的平均值。

总之，在饲料中补充腐植酸不仅可大幅度降低霉菌中毒现象，还可中和草甘膦的抑菌作用，且降低动物产品中的草甘膦累积。此外，在环境治理中应用腐植酸也可显著提高生态系统中的微生物多样性。

参考文献(略)

译自：Chemosphere，2014，104:258～261。