裂解法提取质粒后如何确定其浓度

实验八　流感病毒中血凝素基因的鉴定之一:质粒DNA的提取

一、实验目的

掌握用碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒的方法。

二、实验原理

碱裂解法提取质粒的原理:溶液Ⅰ可使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca²⁺和Mg²⁺螯合，抑制DNase的活性;溶液II裂解细菌，使蛋白质和少量质粒变性;溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性。

因此，用碱处理裂解细菌，可使质粒从大肠杆菌中释放出来，同时可使宿主的线形染色体DNA变性，但闭合环状质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

三、实验材料

(1)带质粒的菌种。

(2)Solution I (1%葡萄糖、50mmol/L EDTA，pH8.0、25 m mol/L Tris-HCl，pH8.0)、Solution II (0.2 m mol/L NaOH、1% SDS)、Solution III (5 mol/L Kac、pH4.8)、TE、异丙醇、70%乙醇。

四、实验步骤

(1)按1%的浓度接种含质粒的大肠杆菌于2ml LB培养基。

(2)37℃振荡培养过夜。

(3)取1.5ml菌体于Ep管，4000r/min离心3min，弃上清液。

(4)加0.1ml Solution I并充分混合。

(5)加入0.2ml Solution II，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。

(6)加入0.15ml预冷Solution III，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。

(7)以10000r/min离心20min，取上清液于另一新Ep管。

(8)加入等体积的异丙醇，混匀后于－20℃静置10min。

(9)再以10000r/min离心20min，弃上清液。

(10)用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

(11)待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中。

五、技术要点

(1)加入碱溶液后，应反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解(液体变清亮)必须马上加乙酸缓冲液中和。

(2)70%乙醇洗涤时，离心后倒上清液时应十分小心，因为这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。