碱裂解法小量制备质粒

实验七　碱裂解法小量制备质粒DNA

一、实验目的

1.了解碱变性法提取质粒DNA的原理。

2.掌握质粒DNA提取的方法。

二、实验原理

质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的，也是比较重要的步骤。从细菌如大肠杆菌或枯草杆菌中提取DNA的方法很多，其分离原理可根据DNA分子大小的不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋、共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有SDS碱裂解法、PEG法、煮沸法以及溴化乙锭-氯化铯梯度离心法，这些方法各有利弊。有的操作繁琐，难以控制，有的纯度不够，有的需要昂贵的仪器，而SDS碱裂解法被认为是一种既经济，DNA得率又较高的提取方法。用这种方法提取的DNA可用于酶切、连接和转化。

碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中；而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术。它对大肠杆菌的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1～500mL以上，从裂解液中获得的闭环质粒DNA，可以根据实验需要，用不同的方法纯化到不同的程度。通常小量制备质粒DNA时需要1～2mL细菌培养物，得到的DNA可以用电泳或限制性核酸内切酶酶切的方法鉴定。

三、器材和试剂

恒温振荡器、超净工作台、台式高速离心机、试管、移液器吸嘴、微量移液器、无菌1.5mL离心管

转化平板

液体LB培养基:

Typtone　　　　　　　10g

Yeast Extract　　　　5g

NaCl　　　　　　　　　10g

加入800mL去离子水，磁力搅拌器搅匀，用5mol/L NaOH溶液调节pH至7.4，定容至1L，将上述培养基灭菌后（121℃，20min）冷却至室温，加入100mg/mL氨苄青霉素溶液，使其终浓度为100μg/mL。

溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50mmol/L EDTA。121℃灭菌20min，冷却后于4℃保藏。

溶液Ⅱ:0.2mol/L NaOH，1%（w/v）SDS。现配现用。

溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60mL，冰醋酸11.5mL，加水至100mL。121℃灭菌20min，冷却后于4℃保藏。

RNase A溶液:10mg/mL，0.1mol/L NaAc pH 4.8，0.3mmol/L EDTA，60～100℃加热10min，自然冷却至室温，分装，-20℃保藏。

氨苄青霉素溶液:100mg/mL，无菌水溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。分装，-20℃保藏。

苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1

氯仿

无水乙醇

70%乙醇

无菌水

四、操作步骤

1.挑取转化平板上白色单菌落，接种于5mL LB液体培养基中（含氨苄青霉素100μg/mL），于37℃振荡器培养过夜（10～12h）。

2.取1.2mL细菌培养物于一支1.5mL离心管中，13 000r/min，离心30s，弃尽上清液。

3.往沉淀中加100μL预冷的溶液Ⅰ，漩涡器上振荡使菌体重新悬浮。

4.往3中溶液加200μL溶液Ⅱ，轻柔混匀至溶液澄清。

5.往4中溶液加150μL预冷的溶液Ⅲ，轻柔颠倒5次，冰浴5～10min，13 000r/min，离心10min，吸上清，转入一个新的1.5mL离心管中。

6.往5上清中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混合物，用力混匀成乳状不分层，13 000r/min，离心5min。

7.吸6中上清，转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，用力混匀，13 000r/min，离心5min。

8.将7中上清吸至新的无菌1.5mL离心管中，加入3倍体积预冷的无水乙醇，用力混匀，-20℃放置10min，13 000r/min，离心5min。

9.小心弃去上清液，加入1mL 70%乙醇，颠倒几次，13 000r/min，离心2min，弃尽液体，室温干燥至沉淀变透明。

10.加入30μL无菌水溶解沉淀，室温放置5～10min，吹打均匀，加入RNaseA（10mg/mL）1.5μL（1/20体积加入，终浓度0.5mg/mL），37℃水浴30min，-20℃保藏。

五、参考文献

［1］　A Zhou，X J iang，X Xu.Improved alkaline lysis method for rapid isolation of plasmid DNA［J］.Biotechniques，1997，23（4）:592-594.

［2］　Ehrt S，Schnappinger D.Isolation of plasmids from E.coli by alkaline lysis.Methods MolBiol，2003，235:752-778.

［3］　〔美〕奥斯伯，等.精编分子生物学实验指南.4版.马学军，等译校.北京:科学出版社，2005.

［4］　〔美〕J.萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.3版.黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008.