多基因遗传病的研究策略

第4节　多基因遗传病的研究策略

多基因遗传病属于复杂的疾病，就遗传因素而言，它们受控于多对微效基因背景上的主易感基因（major susceptibility gene），简称易感基因，发现这些易感基因是认识复杂疾病的关键。目前，多基因遗传病易感基因的研究主要从两方面进行探索：一方面是收集家系资料，用统计学方法进行分类分析、优势对数计分法连锁分析、患病同胞对分析、群体关联分析等来证实主基因的存在；另一方面，用候选基因检测法或遗传标记来定位易感基因，并用定位克隆法来鉴定这些主基因。

一、多基因遗传病易感基因定位的策略

在多基因遗传病易感基因的定位研究中，较多采用候选基因法和全基因组扫描。

（一）候选基因法

将可能与某个多基因遗传病相关的一组已知基因作为候选基因，通过家系调查和连锁分析，找出易感基因。其基本策略和步骤如下。首先确定待研究的候选基因。例如：原发性高血压的候选基因可选择参与血压调节机制的基因，如血管紧张素原基因、血管紧张素转化酶基因、内皮素基因等，已知与单基因遗传有关的高（低）血压致病基因，如醛固酮合成酶基因、11β^－羟化酶基因等；动物研究中发现的有关基因，如SA基因。其次，将候选基因座位的遗传标记与某个多基因遗传病进行连锁分析，确定该候选基因座位是否与某个多基因遗传病相连锁。最后，筛查出与某个多基因遗传病存在连锁关系的候选基因，比较该候选基因在疾病人群与正常人群之间的频率差异，最终确定相关基因。

候选基因法针对性强、方法较简单。但也存在着一些不足，如未知功能的相关基因就不可能被选为某一多基因遗传病的候选基因；即使得到了某一候选基因与多基因遗传病之间存在连锁关系的证据，也不能排除某一相关基因在该候选基因附近的可能性；候选基因法在选择对象时也存在着盲目性。

（二）全基因组扫描

人类基因组中存在着大量可变数量的高度串联重复顺序，如微卫星DNA多态性（MS）和单核苷酸多态性（SNP）。它们具有种类多、分布广、呈高度多态性和易用PCR技术进行扩增等特点，已成为全基因组扫描和定位中最常用的遗传标记。通过多色荧光标记的微卫星DNA引物进行PCR扩增，将扩增产物在DNA自动测序仪上电泳，再用基因组扫描和分型软件，对电泳结果进行图像和数据处理，计算出各个微卫星位点上等位基因的大小和频率。一般用300多对覆盖整个基因组的微卫星引物，选择数个大家系或由300多个患者同胞对组成的样本进行连锁分析，就有可能将某一多基因遗传病的易感基因定位到染色体的区带上，分辨率可达10cM。进一步用该区域内的DNA遗传标记进行精细定位，就有可能将范围缩小到1cM以内，以便直接进行大规模的DNA测序，分离并克隆出某种多基因遗传病的易感基因。

全基因组扫描的应用为多基因遗传病的基因定位带来了希望。一些常见的多基因遗传病，如2型糖尿病、哮喘、精神分裂症、原发性高血压等，都采用该法获得了一些易感基因，但要最终确定致病基因及找到主基因尚有许多细致的工作要做。此外，该法也存在着工作量大、技术要求高、费用昂贵等问题。

二、常用的遗传分析方法及其应用

（一）连锁分析

每个基因都按严格的顺序和一定的间距线性排列在染色体上。同一条染色体上的基因之间存在着连锁关系。当细胞减数分裂时，同源染色体之间可发生交换，进行基因重组，其频率称为重组率（θ）。根据基因的重组率来计算两基因之间的染色体图距称为连锁分析（linkage analysis）。目前常用优势对数计分法（log odds score，简称为lods法）进行连锁分析。lods法主要检测在两基因以某一重组率（θ）重组时，出现相连锁的似然性（likelihood，L）有多大。其基本公式为

式中，L（θ）表示重组率为θ时相连锁的可能性；L（0.5）表示重组率为50%即不连锁的可能性。

L（θ）与L（0.5）之比的对数就是连锁优势的对数计分。该法的优点在于：①可用于两代小家系资料的分析；②每个家系的计算结果可逐个相加，无时间限制；③结果判断较容易，如Z＞1支持连锁，Z＞3肯定连锁，Z＜－2否定连锁。重组率的判断为θ＜0.10为紧密连锁，θ＞0.20为松弛连锁，0.10＜θ＜0.20为中度连锁。

连锁分析已被广泛地应用于病理机制不明的单基因遗传病和部分多基因遗传病的基因定位。其原理是通过对致病基因与众多的遗传标记之间的连锁分析进行基因定位。这种方法最适用于有多个患者的大家系研究，但要求临床诊断要明确，致病基因有强效作用，以及已知可能的遗传模式。而对具有复杂性状的多基因遗传病在进行连锁分析时，往往可能受到多种因素的影响，如拟表型、不完全外显率、不同的发病年龄、选型婚配、环境因素和教养因素的影响等。成功的例子有通过对乳腺癌的综合分离分析和连锁分析，将乳腺癌主易感基因（BRCA₁）用此法定位于17号染色体。

（二）受累同胞对分析法

受累同胞对（affected sib－pair，ASP）分析法是连锁分析的一种特殊形式，其特点是对系谱材料的要求低，只需一代或二代的家系成员，分析时不需准确拟定疾病表型的遗传模式，不受遗传参数的影响，对遗传异质性容许度较大，因此特别适合多基因遗传连锁分析。

ASP分析涉及一个基本概念“血缘同一”（identical by descent，IBD），即一条染色体的DNA区域或等位基因有一个共同祖先的起源。假如亲代基因型已知，在零假设的情况下，同胞对中任何位点IBD的机会分别是0、l、2，基因型分布分别是25%、50%和25%。显然，同胞对IBD的机会要高于其他亲戚对（如祖孙对、叔侄对、表兄妹对和半同胞对），更明显高于随机孟德尔分离群体。根据IBD的概念，当某个微卫星标记与一个疾病易感位点相连锁时，平均ASP的IBD将高于随机同胞对。当ASP的IBD超过随机同胞对的5%～10%（P＜0.05）时，就可进行基因定位分析。

例如，在精神分裂症的研究中已采用这一方法。以美国为主的研究小组在对爱尔兰256个精神分裂症家系进行连锁分析时，发现染色体6p24－22区域的一个遗传标记位点可能与一个有中度效应的致病基因连锁；同时对这些家系的异质性研究显示，与该基因相连锁的现象存在于15%～30%的家系中。以德国为主的联合小组对染色体6p的研究结果提示具有遗传标记连锁位点，部分中国人的样品在D6S285处存在连锁，而在欧洲人种上未能得到重复。总之，在染色体6p24－22区域存在着起很小效应的精神分裂症致病基因，而此区域又是人类白细胞抗原（HLA）位点末端区，提示可能与HLA有关。

（三）关联研究

关联研究（associated studies）是基于群体中无亲缘关系的病例组和表现型正常的对照组在某个遗传标记位点上会出现不同的频率而设计的。通过两者频率的差异，就能推测所研究的遗传标记和某个遗传病易感位点之间是否存在因果关系。肯定存在遗传标记与疾病关联的现象可归纳为两种：一种是致病基因位点与遗传标记位点存在很强的连锁不平衡（linkage disequilibrium），另一种是遗传标记位点本身与多基因遗传病的发生有关。

连锁不平衡的原理是遗传标记位点和致病基因位点之间如果足够近，则在减数分裂时它们就不会随机重组分离。连锁不平衡可以被认为是对连锁分析的补充，但在未知连锁的条件下，也可以通过连锁不平衡确定致病基因位点。连锁不平衡相对于连锁分析而言，更易找到只有很弱效应的基因；相对于其他几种遗传模式而言，连锁不平衡更适合于多基因遗传模式。但在实际检测中，连锁不平衡也有不利方面，只能在一定条件下有效，如需要低的突变率、遗传标记位点与致病基因位点之间足够近等，以避免频繁的重组和需要大的样本量。

目前连锁不平衡已用于多基因遗传病易感基因的研究，如强直性脊柱炎与HLA－B27存在显著关联。病例组与HLA－B27的关联高达90%，而一般群体只有9%的关联。22q12－q13区域的遗传标记D22S278和D22S283与精神分裂症间存在等位基因关联。

（四）动物模型的多基因分析

以人类作为多基因遗传病研究的材料有着一些难以克服的弊端：①人类的世代长，不利于研究三代或三代以上的家系；②人类遵循随机婚配的原则，而且不能拿人做遗传学实验；③多基因遗传病均不同程度存在着遗传异质性的问题；④多基因遗传病还受环境因素的影响，病因学复杂。

要解决这些问题可先建立动物模型，通过动物模型的分析，找出与人类相近的病理变化，以及控制这些变化的遗传基础。常用的有啮齿类的小鼠。小鼠世代短，多胎妊娠，且与人类基因组之间具有较高的同源性，为研究提供了丰富的实验材料，选择纯种小鼠可消除遗传异质性的影响，可根据需要，将小鼠改造成转基因小鼠、基因剔除小鼠和基因替换小鼠。

动物模型在人类多基因遗传病的研究中起着越来越大的作用。例如：小鼠遗传性高血压的多种实验模型的建立，定位了十多个与血压变异有关的位点；在肥胖伴糖尿病的小鼠中发现一种ob／ob基因，该基因与人类存在84%的同源性，该基因的缺失会导致leptin蛋白的缺乏，从而产生严重肥胖和糖尿病的发生。这些动物模型的研究均为人类攻克高血压、肥胖和糖尿病等提供重要启示。

总之，多基因遗传病的遗传分析和易感基因的定位是一个复杂的系统工程，随着人类基因组计划的快速发展、各种信息资源的高度共享和新技术的不断出现，多基因病的基因定位将日益完善，多基因病的基因诊断和基因治疗将成为可能。

（肖福英）