质壁分离蔗糖溶液浓度

第二节　细胞核与线粒体的分级分离

一、所需试剂及设备

小白鼠、冰块、玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、蜡盘、平皿、牙签。0．25mol/L蔗糖－0．003mol/L CaCl₂溶液、1%甲苯胺蓝染液、0．02%詹纳斯绿B染液、0．9%NaCl溶液。

［附］ 溶液的配制

1/300詹纳斯绿染液：取詹纳斯绿1g，加Ringer液300ml。现用现配。

1/3 000中性红染液：称取中性红（neutral red）0．1g，加蒸馏水300ml。室温保存。

Ringer液：

NaCl　　　　　　　　0．9g

KCl　　　　　　　 　0．042g

CaCl₂　　　　　　　 0．025g

蒸馏水　　　　　　　100ml

0．25mol/L蔗糖－0．003mol/L氯化钙溶液：

蔗糖　　　　　　　　85．5g

CaCl2　　　　　　 　0．33g

蒸馏水　　　　　　　1 000ml

二、操作步骤

（一）制备肝细胞匀浆

将小白鼠用颈椎脱位法处死，迅速开腹取肝，剪成小块（去除结缔组织）尽快置于盛有0．9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

称取1g肝组织（湿重）放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0．25mol/L蔗糖－0．003mol/L CaCl₂溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全加入该溶液。剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用8层纱布（先用蔗糖液湿润）过滤匀浆于离心管中，然后制备涂片①，做好标记，自然干燥。

（二）分级分离与观察

1．细胞核的分离提取与观察：将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2 500r/min，离心15min；缓缓取上清液，移入高速离心管中，放在冰块中，待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②，做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行下一步骤。

用6ml蔗糖－氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2 500r/min离心15min弃上清液，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载片上，即涂片③，自然干燥。

将涂片①、②、③用1%甲苯胺蓝染色后盖片即可观察。

2．线粒体的分离提取与观察：将上述装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17 000r/min离心20min，弃上清液，留取沉淀物。加入0．25mol/L蔗糖－0．003mol/L氯化钙溶液1ml，用吸管吹打成悬液，以17 000r/min离心20min，将上清液吸入另一试管中，留取沉淀物，加入蔗糖－氯化钙溶液0．1ml混匀成悬液（可用牙签）。取上清液和沉淀悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记④、⑤涂片），各滴一滴0．02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染色20min。

油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。