测量溶液浓度的光谱技术有

1.材料培养与UV辐射剂量设置

见第二章第二节材料与方法。

2.提取液(酶液)的制备

取一定体积的培养液，8000r/min，4℃离心10min，去除上清液。加入适量的磷酸缓冲液(pH=7.8，4mM ETDA-Na2，0.4%PVPP)和少量石英砂在冰浴中研磨。再次离心20min，收集上清液。2～3h内使用，冰浴中保存备用。

3.ROS含量的测定

采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定，其原理和方法如下:

由于H2O2和Fenton反应产生的羟自由基与H2O2的量成正比，当加入电子受体后，能使gress显色剂形成红色物质，该物质的呈色与羟自由基成正比。根据该原理在分光光度计上比色即可测定ROS自由基的含量。

在37℃水浴下，向Fenton中加入上述酶液，1min后，加入显色剂终止反应，静置15min，在酶标仪上测定550nm处的光吸收值。

4.SOD活性的测定

参照李合生等(2000)的方法。

取4支透明度较好的5mL指形管，2支为测定管，另2支为对照管，按表3-1加入各溶液，混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lux日光下反应20min。至反应结束后，以不照光的对照管作空白，于酶标仪上分别测定其他各管在560nm处的光吸收值。

一般SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算:

式中:SOD总活性以鲜重酶单位每克表示;ODCK为照光对照管的光吸收值;ODE为样品管的光吸收值;V为样品液总体积，单位mL;Vt为测定时样品用量，单位mL;W为培养物鲜重，单位g。

表3-1　各溶液显色反应用量

5.MDA含量的测定

参照李合生等(2000)的方法。

取10mL藻液，8 000r/min，4℃离心10min，弃去上清液，加入5%的三氯乙酸(TCA)和少量石英砂，研磨至匀浆，再离心10min，收集上清液。取2mL上清液，加入2mL 0.67%的硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混匀。于沸水浴中反应30min，迅速冷却至室温，离心。上清液于532nm、600nm和450nm处测定光吸收值。按下式计算:

根据藻细胞的鲜重计算出单位鲜重的MDA含量C(μmol/g)。

6.Proline含量的测定

参照张殿忠等(1990)和李合生等(2000)的方法。

标准曲线的绘制:配制标准溶液为100μg/mL的脯氨酸溶液。向6个分别装有0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL的50mL容量瓶中，加入蒸馏水至刻度，摇匀。分别取2mL脯氨酸溶液、2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液(0.625g茚三酮溶于15mL冰醋酸和10mL6mol/L磷酸中)，沸水浴保温30min。冷却后，分别加入4mL甲苯，振荡，静置。取上层脯氨酸甲苯溶液于520nm处测定光吸收值。

取10mL藻液，8000r/min，4℃离心10min，弃去上清液，加入5mL 3%的磺基水杨酸溶液，沸水浴抽提10min，再次离心得脯氨酸提取液。按上述方式测定提取液在520nm处的光吸收值。