血细胞染色体检验

第六节　血细胞染色体检验

血细胞染色体检验主要包括染色体非显带技术、染色体显带技术、染色体高分辨技术、姐妹染色体互换技术、染色体脆性部位显示技术和早熟凝集染色体技术等。20世纪80年代发展了染色体原位杂交技术，这一技术将分子探针与染色体杂交结合，它不仅用于分裂中期细胞，而且可检测分裂间期细胞，拓展了检验范围，提高了检测的灵敏度。自动化染色体分析技术提供了采单式操作，故简单易行，在资料储存、染色体图像处理和核型分析方面显示了独特优势，提供了高效、快速和方便的细胞遗传学研究手段。

一、染色体非显带技术

（一）原理　非显带技术是染色体的基础。染色体制备的关键是获得足够的分裂期细胞。人体增殖细胞如骨髓可直接获得分裂中期细胞，而外周血需体外培养，PHA刺激细胞分裂来获得分裂中期细胞，骨髓细胞染色体制备方法包括直接法和培养法。

1.直接法　用抗凝骨髓不经培养，以PBC稀释后加秋水仙素“阻断”中期细胞，经低渗液处理后，再经预固定、固定后即可制片镜检。秋水仙素能干扰有丝分裂纺锤体形成，使细胞“阻留”在分裂中期，增加可供分析的中期细胞数目。低渗处理则使染色体彼此铺展开来便于分析。

2.短期培养法　抗凝骨髓标本在含小牛血清的培养基中于37℃培养24或48小时，加入秋水仙素“阻断”中期细胞，其他同直接法。

（二）非显带染色体命名

1.染色体的结构和形态　每一中期染色体的二条染色单体通过着丝粒联结，该处为染色体的缩狭处，故又称为主缢痕，其位置在各个染色体上也各不相同，因而把染色体分为大致相等或长短不同的两个部分，较短的一端称短臂，较长的一端称长臂。①着丝粒的位置或接近染色体中央，称中着丝粒染色体。②着丝粒偏于一端，称亚中着丝粒染色体。③着丝粒接近一端，称近端着丝粒染色体。有些丝粒染色体的短背可见一个球形小体，称随体，在正常人都染色体中，可以出现随体的有13、14、15、21和22五对，但并不是每个人每个细胞都同时出现。

2.染色体识别的指标　着丝粒的位置和相对长度是染色体的最主要的特征，由此就有了识别染色体的三个重要指标：①染色体相对长度，即每条染色体的长度占22常染色体和一条X染色体总长度的百分率；②背率：测到的长背（q）与短背（p）之比，即q／p；③着丝粒指数：指每条染色体短背的长度占该染色体总长的百分率。随体的有无亦是识别染色体的一个指标。

3.染色体的分组和正常核型　①染色体分组：人类有23对（46条）染色体，其中22对为男性和女性共有，称常染色体；另一对与性别有关，称性染色体，男性为XY，女性为XX。依据以上识别指示，按大小将人类染色体顺序编号为1～22，并分为A～G共七个组，性染色体表达为X和Y，分别归入C组 和G组；②正常核型：指个体体细胞的染色体组成。用显微摄影或显微描绘的方法得到单个细胞中所有的染色体，并按照编号顺序系统地进行排列，观察核型。正常男性记作46，XY，正常女性记作46，XX。

二、染色体常规显带技术

（一）原理

1.G显带方法　指标本先经某种处理，再以姬姆萨染色后使染色体显带的方法。G显带的机制较复杂，一种观点认为DNA上富含A-T碱基对的DNA和组蛋白结合紧密，胰酶处理时不易高度抽提，和染料亲和力强，呈深带；而富含G-C碱基对的区段结合蛋白质被胰酶抽提，和染料亲和力降低，呈浅带。

2.R显带方法　R带带纹与Q带、G带正好相反，即前者的阳性带相当于后者的阴性带，而前者的阴性带相当于后者的阳性带。R带按制备方法不同可分为荧光R带和姬姆萨R带两种类型。Dutrillaux等所创立的热处理R显带为最基本方法。其显带机制尚未完全明了，可能由于DNA受热变性，使富含A-T碱基对的区段单链化，故不易为姬姆萨染色，呈浅色；而富含G-C碱基对的区段仍保持正常的双链结构，易于染色，呈深带。

（二）显带染色体的命名

1.显带染色体的概念　经某种特殊处理或染色染色后，染色体上可显示出一系列的连续的明暗条纹，称显带染色体。显带染色体解决了染色体识别困难，为深入研究染色体异常和基因定位奠定了基础。

2.显带染色体的命名　显带染色体上明暗条纹成为带，染色体上明显而恒定的形态特征，如着丝粒和某些特别的带称作界标。两个界标之间的区域称为染色体区。区的划分是以着丝粒开始向短臂（p）或长臂（q）的臂端延伸，依次编为1区，2区，3区等。用作界标的带就是该区的1号带，例如6 p 23，表示第6号染色体短臂，2区，3带，由上可知，在表示一个指定的带时需要四项内容，即染色体号、臂号、区号、带号。如果一个带需要再分，就成为亚带，亚带的描述就是在带的后面加一小数点，在写出指定的亚带数，如6 p 23.1即是第6号染色体短臂，2区3带的第1亚带。

三、染色体高分辨显带技术

染色体高分辨显带技术　中期染色体常规显带方法在一套单倍体仅能显示322条带，分裂中期的早、中阶段染色体较长，而晚中期以后的染色体较短小，为了获得较长而带纹更加丰富的染色体，采用某些药物如甲氨嘌呤等阻断DNA的合成达一定时间，细胞高度阻滞在细胞周期的某一位置，当阻断作用解除后各细胞的DNA的合成重新同步进行，细胞即处于同一分裂周期，可获得分裂较早期的细胞。在上述同步化基础上，使某种抑制剂抑制染色体的收缩，可使染色体长度增加20%左右，显带后可达400～800条带，即所谓的高分辨染色体显带。

四、姐妹染色体单体互换技术

姐妹染色体单体互换技术的原理是将5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入DNA分子，DNA分子双链如经过两次复制均掺入5-溴脱氧尿嘧啶核苷则染色变浅。其方法是在细胞培养液里加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷，它作为胸苷的类似物在DNA链的复制过程取代了胸苷。由于DNA复制是半保留复制，在第一个周期时每条染色体单体的DNA双链中均有一条链被取代，因而两条单体没有不同，但到了第二次复制后，染色体的一条单体的双链中仍有一条未被取代而另一条单体的却被5-溴脱氧尿嘧啶核苷取代。此时用hoechest-33258荧光染料染色，DNA双链上均有5-溴脱氧尿嘧啶核苷的染色单体的荧光强度比一股DNA含有5-溴脱氧尿嘧啶核苷的染色弱。现可用Giemsa染色显示姐妹染色体单体互换，而不需要用荧光染色。该技术为肿瘤细胞遗传学、染色体分子结构、DNA复制、DNA损伤修复、细胞周期及检验多种致癌剂的发病机制等研究提供方法学。

五、临床评价

（一）染色体异常　染色体异常是指染色体数量和结构异常，有称染色体畸变。

1.染色体数目异常　①多倍体：人类生殖细胞染色体为23条，体细胞染色体46条，称二倍体（2n）。在某些病理条件下，染色体的数目成倍的增加，称多倍体，如三倍体（3 n），四倍体（4n）等。在恶性血液病中常见。②非整倍体：染色体数目的增加或减少不是成倍的，称为非整倍体。少于46条者称亚二倍体，少于69条者亚三倍体；多于46条者称超二倍体；多于69条者超三倍体。如果染色体是2n，但不是正常的23对，而是个别的染色体增加，其他染色体相应减少，成为假二倍体。在急性白血病及恶性淋巴瘤中常见多种非整倍体。③嵌合体：同一个体具有两种或两种以上不同核型的细胞，成为嵌合体。有性染色体和常染色体嵌合体，常见于先天性异常的患者。人体恶性肿瘤的核型改变不能算嵌合。

2.染色体结构异常　导致染色体发生结构改变的基础是断裂及断裂后的重排。染色体的断裂可以是自发的，也可是某种致畸因素引起的。常见的染色体结构异常如下几种：①缺失（del）：是指染色体的长臂或短臂部分阶段的丢失，包括末端缺失和中间缺失；可见于急性单核细胞白血病的del（11）（q23）即是11号染色体长臂2区3带断裂，末端缺失。②倒位（inv）:一条染色体两处断裂后，形成三个片段，重建的染色体片段倒转1800后又重新结合，即倒位。如inv（3）（q21 q26）就是发生在3号染色体长臂内的倒位。③易位（t）：是指染色体断裂的断片离开原来的位置而接到同一条染色体的另一处或另一条染色体上，从而导致染色体的重排。无着丝粒的断片易位到同一条染色体上称移位；无着丝粒的断片易位到另一条染色体上称转位；二个染色体发生断裂后相互交换片断称相互易位。易位是白血病、淋巴瘤中十分常见的染色体结构异常。④环状染色体：当染色体的长臂和短臂两末端处断裂，两端断裂面相互连接，即形成环状染色体。在辐射时常见。⑤等臂染色体由于染色体的分裂不是纵裂，而是横裂，结果产生的两条新染色体，一条有原来染色体的两条的长臂没有短臂，另一条染色体有有短臂而没有长臂，这种染色体称为等臂染色体。⑥脆性位点指在接触某种特殊的化学物质或体外培养条件所出现的非随机的染色体裂隙、断裂。

3.异常核型的表示　异常核型的描述：对异常核型有简式和繁式两种描述方法，临床多使用简式描述。对肿瘤细胞等异常核型的描述，按照ISCH对肿瘤细胞命名进行。染色体的数目异常描述，是“﹢”或“﹣”号后写上染色体号或性染色体，表示该染色体获得或丢失；如“﹢”或“﹣”号写在染色体后，表示该染色体部分获得或部分丢失，如46，XY，-5表示少了一条5号染色体，46，XY， 5-表示5号染色体部分缺失。然后描写结构异常，如46 ，XY，t（5；17）（q32；q12），即表示第5号和第17号染色体出现易位，断点在5号染色体长臂第3区2带以及第17号染色体长臂第1区2带。

（二）染色体异常的临床意义　血液病染色体检验是血液检验的重要内容，是遗传性疾病、恶性血液病研究不可缺少的方法。染色体异常，特别是染色体易位，常涉及癌基因易位，新产生的融合基因及产物在肿瘤的发生、发展中起重要的生物学作用；特异染色体异常同肿瘤细胞的形态学、肿瘤的预后及治疗效果判断有密切关系，临床上已经用于疾病的诊断、分型、治疗方案的选择，在预后判断和微小残留病灶的检测等方面去，发挥重要作用。

1.在白血病中的作用

（1）在白血病诊断和分型中的应用：常规显带技术可在50%～80%急性髓性白血病中发现克隆性染色体异常，在AML中最常见染色体异常是+8、-7和-5，在大多数AML亚型中可见到这几种异常。染色体易位、缺失、倒位是常见的染色体结构异常，特异性（原发性）染色体异常是指在疾病的早期 阶段发生、与疾病的发生有关并决定疾病的基本生物学特征的一类染色体异常。如t（8；21）（q22；q22）异常绝大多数见于AML-M2型，t（15；17）（q22；q22）目前仅见于AML-M3型，可作为M3的诊断标准。75%左右的急性淋巴细胞白血病患者可见染色体数目和结构异常。数目异常特别是超二倍体较多见，亚二倍体较少见。结构异常则可发现几十种之多。染色体异常与ALL的免疫分型相关。例如Ph染色体t（9；22）（q34；q11）可见于20%～30%的前B细胞-ALL；t（4；11）（q21；q23）可见于具有早期前B细胞-ALL。

（2）在白血病预后判断、指导治疗中的作用：AML中具有t（15；17），inv（16），t（8；21）异常的病人对治疗反应良好，缓解期较长，而具有-5、-7及t（9；22）的AML病人则预后较差。在AML中，染色体数超过50的超二倍体对治疗反应良好，其次是47-50的异常者及正常核型者，而t（9；22）、t（4；11）和t（8；14）者预后很差，中数生存期多小于1年。

当慢性粒细胞白血病患者出现双倍体ph，+8，i17q等新的异常克隆时，往往预示着急变。

（3）鉴别白血病微小残留病灶：微小残留白血病（MRL）是指白血病経化疗或骨髓移植后达到完全缓解，而体内残留微量的白血病细胞的状态，估计此时仍有106～108个白血病细胞的存在，但形态学方法难以检出白血病细胞。在白血病微小残留病灶检测中，FISH技术的灵敏性远远超出常规技术，通过设计多种探针直接对中期和间期染色体检测，可以发现各种染色体数目和结构异常，达到103个细胞中检出一个异常细胞的水平。常规显带技术若能观察到500个分裂象，异常细胞的检出率为1%。因此，细胞遗传学技术常作疾病即将复发的监测。当临床及形态学还没有复发的证据时，检测到原已消失的克隆性染色体异常和新的克隆性染色体异常时，往往预示疾病的复发。

2.在骨髓增生异常综合征的应用　染色体异常常见于40%～80%的MDS，常表现为染色体的丢失、部分缺失，亦可见染色体增加和结构异常，如-7、-17、-Y、5q-、7q-以及+8、+11和t（3；3）（q21；q26）、t（5；17）（q32；q12）等。

3.在淋巴瘤中的应用　越来越多的证据表明核型异常与淋巴瘤亚型有关。如大多数Burkitt淋巴瘤具有t（8；4），少数为t（2；8）t（8；22）。淋巴瘤核型异常的预后价值也是明显的，如约85%的滤泡性淋巴瘤具有t（14；18），或单独存在或与其它异常一起存在，前者预后良好后者预后较差。

4.在其他血液病中的应用　在骨髓增生性疾病中，细胞遗传学为真性红细胞增多症是一种克隆性疾病提供了依据。约40%的真性红细胞增多症有克隆性染色体异常，常见的染色体异常有del（2v）（q11），+8和+9，可见于本病的始终，对临床表现和病程影响很小。染色体核型分析对鉴别原发和继发红细胞增多症提供了有力证据。

原发性骨髓纤维化染色体异常核型检出率30%，常见有-7、-9、+8、+2或1q、13q等结构异常。

5.在骨髓移植中的应用　在骨髓移植中性别染色体常作遗传标记，方法稳定而简便。在供受体性别不合时，当男性受者接受了女方的骨髓，在移植后，造血细胞中的X染色体消失或女方性受者接受了男性骨髓，造血细胞中出现Y染色体，均说明完全植入。利用显带技术等，经常发现于13、14、15、21、22等染色体上的随体也可以作为植入的遗传证据。如果移植前具有随体的受体移植后随体消失或移植前无随体的受体移植后出现随体，均可说明植入。