从临床前研究到临床试验

◎William Cruz-Munz，Giulio Francia，Robert S. Kerbel

转移是肿瘤进展的顶点，并一直是癌症患者死亡的主要原因和癌症治疗方面面临的最大挑战。转移性疾病主要的系统性治疗——化疗的主要目的是通过设计使用最大耐受剂量(MTD)的细胞毒性药物，以杀死尽可能多的肿瘤细胞［1，2］。然而，这种方案有其局限性。例如，高剂量的化疗药物可导致毒性，有时会相当严重(如骨髓抑制和破坏肠黏膜)。正因为如此，这需要纳入延长的治疗间隔(通常3个周)，以便恢复耗尽的细胞(如中性粒细胞从骨髓祖细胞分化)［3］。不幸的是，这样间歇也会允许肿瘤重新增长，MTD治疗取得任何成果通常只是暂时的［2］。此外，由于肿瘤细胞具有获得抗细胞毒性药物的遗传能力，多数MTD治疗最终会失败，导致病情恶化。因此，治疗晚期转移性疾病，多数的MTD疗法已被证明无效或疗效甚微(大多是治标不治本)［3］。

显然，正在反思和研究治疗转移性疾病新的策略，例如重新审视化疗药物的剂量与用药方案。笔者和其他研究小组支持选择化疗药物的剂量与疗程的替代临床策略，即以节律性、较小间隔时间(没有延迟无药间歇期)、长疗程给予远低于MTD的较低剂量化疗［4-5］。这种“节律性”方案的明显优势是可以显著降低毒性，可以减少骨髓抑制，甚至不需要为加快骨髓抑制的恢复而使用生长因子或支持治疗药物(如止吐剂)。但许多MTD疗法一般都需要辅以支持治疗［3］。

与MTD疗法不同，节律性化疗方案的主要靶点是肿瘤新生血管的内皮细胞群。这种方法的依据是新生血管形成在控制肿瘤生长中发挥了关键作用，并假定内皮细胞作为抗癌疗法的重要靶点［2，6］。因为肿瘤相关内皮细胞比肿瘤细胞的增殖率低，可能无法被MTD方案有效地靶向［7］。但是，节律性化疗方案的特征是频繁地低剂量给予化疗药物，可更有效地靶向这些内皮细胞的增殖。

曾经认为靶向血管内皮细胞还有另一个好处，这些宿主细胞被认为遗传学稳定，很少对抗血管生成药物产生影响［8］。当使用靶向宿主血管内皮细胞“直接作用”的抗血管生成药物时，在某些情况下，甚至可维持对耐药性癌细胞的持续活性［9，10］。这一点对转移性疾病特别有用，因为其常常对化疗药物耐受或反应性甚差，或者能迅速获得抗药性。然而，现在还是容易出现抗血管生成药物的耐药性。可能是由于这些疗法导致肿瘤微环境的改变，由此促进对抗血管生成治疗产生耐受［11］。也有证据表明(至少在原发肿瘤模型中)，虽然节律性化疗能够延缓抗药性肿瘤的生长，但最终肿瘤可能会摆脱这种治疗的控制并出现复发［9］。节律性化疗可与抗血管生成等靶向生物疗法联合以提高疗效，这种组合已在临床前试验中获得意外强烈和持续的抗肿瘤反应［3，5，12-14］。布劳德等［9］的研究表明，节律性化疗后复发可同时给予血管生成抑制剂TNP-470予以控制。根据笔者经验，使用长春新碱的节律性化疗能够延缓SK-NMC神经母细胞瘤(种植在免疫缺陷小鼠皮下)的增长，尤其是节律性长春新碱化疗与抗VEGFR2抗体(DC101)联合应用时，可获得长达7个月的肿瘤持续抑制［15］。

节律性化疗还可通过抑制血管生成以外的作用机制导致抗肿瘤［3］。例如，在晚期肿瘤患者，每日口服低剂量CTX，可诱导循环调节性T细胞水平下降，导致外周T细胞增殖和NK细胞活性升高［16］。此外，节律性化疗也可能导致直接肿瘤细胞毒性作用。在不同类型肿瘤的临床前移植模型中［9，15，17，18］，节律性化疗的疗效已被证明;某些比较MTD和节律性化疗的研究，已显示后者具有更好的抗癌作用［19］。

由于血管生成在原发肿瘤和转移灶的生长中均是必要的过程［20］，因此，可以假设节律性化疗介导的抗血管生成活性将扩张至转移性疾病的治疗。确实，这种方法对晚期转移性疾病的疗效目前正在进行临床前和临床评估。本章主要阐述节律性化疗对晚期转移性疾病的意义，以及可以用来测试这种治疗策略有效性(包括使用其他药物或治疗方案)的新型临床前模型的发展。

9.4.1 异位移植模型用于抗肿瘤活性的预测

有效抗转移疗法的发展没有明显进展主要是由于疾病本身的特性(侵袭性和获得性抵抗)，滥用或甚至缺少测试和评估新型疗法疗效的恰当转移性疾病模型也是另外原因［21］。历史上，抗肿瘤活性的研究大多采用鼠或人类肿瘤皮下异种移植模型。最近，原位移植原发肿瘤或遗传工程小鼠模型的自发性原发瘤已越来越多地使用。不过，通过使用所有这些模型所获得的可喜结果，一般与相近类型晚期转移性肿瘤临床试验的结果并没有很好地匹配［21，22］。同样，回顾转移治疗实验，在开始治疗时几乎总是包括那些容易治疗的镜下微小残留病灶［23，24］。

使用移植性或自发性原发瘤模型的困境在于其不能重现进展性内脏转移的治疗。虽然这些模型可能有助于确定潜在有效的抗肿瘤药物，但需要联合其他保护进展期转移性疾病的临床前模型，以确定治疗药物对某种类型肿瘤及相关远处转移部位的治疗作用［23］。例如，对于节律性化疗诱导的抗血管生成作用，原发肿瘤内血管内皮细胞可能不会与转移灶生长发生类似方式的治疗反应。这种治疗灵敏度的差异是因为不同部位内皮细胞的异质性，以及微环境本身的差异(如不同的生长因子或细胞因子的存在)。

正如Fidler指出［25］，抑制皮下肿瘤的血管生成并不能表明对转移性部位也有作用。事实上，以笔者的经验，原发性人类异种移植肿瘤模型即使在原位成长，也并非是预测抗转移作用的理想模型［12，20，26］。因此，要尽量减少临床前和临床结果之间的脱节，有必要重新审视采用传统肿瘤治疗模型来评估抗转移化疗方法(无论节律性还是MTD)有效性是否恰当，并应考虑使用更合适的临床前转移模型［27，28］。

9.4.2 临床前转移模型(同源与异种)

较早的体内转移模型大多是同源性的，因此采用如小鼠B16黑色素瘤等鼠源性细胞株。细胞一般通过静脉注射制作肺转移克隆模型［29］。用于这种目的的多种同源细胞株已在许多综述中广泛讨论［29-31］。同源模型的优点是可用于检测免疫宿主转移过程的特异阶段，从而评价宿主免疫反应对转移的影响［30］。然而，使用小鼠细胞系存在一些弊端，在许多方面不能充分代表人类肿瘤生物学的特征。因此，小鼠肿瘤细胞株可能不能完全反映人类肿瘤发生的分子改变［30，32］。例如，小鼠罕有出现黑色素瘤等自发性癌症;目前在60%～70%的人类恶性黑色素瘤中存在激活的b-raf基因突变［29］，但在小鼠黑色素瘤细胞系中还没有发现［33］。早期的同源转移模型也缺乏反应临床症状的转移部位特异性［34］。同源模型还有缺点是:许多抗人类特异性抗原的抗体常常对小鼠组织无法发生交叉反应，因此，不能用于这些肿瘤的临床前研究［32］。

为了克服同源模型的一些缺陷，已经开发了多种肿瘤类型的人类异种移植模型［32，35，36］。通过直接植入人类肿瘤活检组织或注射建立的肿瘤细胞株已成功进行异种移植。前者具有保留原发瘤的形态学和分子标记的优势。但是，使用这些人类肿瘤往往很难建立细胞系，而后者是体外研究的持续资源［21］。这就是为何细胞系是更加有用的工具，可同时进行体外研究(生物化学、分子生物学、药理学与药效学等)和体内研究。尽管异种移植模型具有各种优势，但它需要在免疫特许部位(如大脑或眼睛前房)或更多免疫缺陷鼠(胸腺切除/照射所产生的裸鼠或SCID)，以避免肿瘤细胞排斥［37］。然而，这样就难以研究转移肿瘤扩散过程中免疫系统的潜在作用［30］。这些免疫缺陷鼠的另外一个不足是也会出现某些表型的改变，如血管生成等在转移过程中发挥核心作用的步骤［38］以及不同肿瘤在小鼠不同品系的肿瘤转移范围和程度明显不同［39，40］。因此，模型的选择依赖于研究的实验目的。

9.4.3 实验性和自发性转移模型

实验性转移模型(有时称为“人工”转移)是被广泛用于研究小鼠转移性疾病的生物学和治疗的方法。在这些模型中，肿瘤细胞由静脉(尾静脉)注射产生远处转移，通常在肺部，或通过动脉内注射靶向中枢神经系统(CNS)或骨［29］。这种转移模式有许多优点，包括可控制注入细胞的数量，以形成大小相对一致、部位明确以及特定时间的转移灶［30］。因此，实验性转移模型成为药物和生物制剂活性研究的重要工具，在促进了解转移级联过程的肿瘤细胞血管内渗过程以后阶段的相关机制、过程以及分子等也发挥作用。然而，由于这些模型是直接将肿瘤细胞注入血液循环，并不能反映临床转移事件的完整过程，特别是许多转移的早期步骤［29，41］。另一个缺陷是用于研究抗转移作用，需要在肿瘤细胞接种后很快或者接种之前启动治疗，这不是模型本身固有的而是临床研究设计的不合理所致。

在“自发性”转移模型中，肿瘤细胞从原发瘤部位自发地播散，并按照细胞播散的多步骤自然过程形成远处转移灶，常(并非总是)发生在肝和肺等相关部位，这些可反映疾病的临床表现［42］。但是，这些模型所产生的转移灶有限而影响其应用。而人类肿瘤皮下移植模型一般很少发生自然性转移［35］。异位移植瘤的转移扩散低效是由于生长因子和细胞相互作用的差异，而后者被认为是特定肿瘤类型转移过程所必需的，在皮下微环境中缺乏［25，43］。此外，皮下肿瘤可能被一个突出的纤维囊所包绕，阻碍其局部侵袭，继而影响远处转移。事实上，早在19世纪，Paget就已指出肿瘤细胞转移不仅取决于肿瘤细胞的特性，也取决于周围微环境的相互作用［43，44］。因此，越来越多的肿瘤细胞原位移植作为更加符合生理学的转移模型用于转移研究中。同样，也有各种肿瘤原位移植的自发转移模型(表9-2)。

表9-2 人类肿瘤原位移植的自发性转移临床前模型

9.4.4 原位移植肿瘤转移模型

(1) 黑色素瘤

黑色素瘤是最实用的原位移植模型之一，因为其靶部位(皮下)注射方便，大量的黑色素瘤细胞株可在免疫缺陷小鼠上生长和转移［10］。技术的关键是避免意外注射到真皮以下［10，52］，将导致皮下肿瘤。随后，原发肿瘤的快速增长可能会限制转移扩散的程度，小鼠可能会在明显转移之前即死于局部原位肿瘤［23］。因此，成功建立原位黑色素瘤转移模型的关键是成功切除原发肿瘤。然而，这也适合乳腺癌等肿瘤模型。要求切除原发瘤也可以被理解为CAR。正如Folkman等的建议，原发肿瘤释放的内源性血管生成抑制剂可能抑制远处转移灶的增长［53，54］。所以，切除原发肿瘤可以消除这种远处、全身性抗血管生成作用，并允许或促进协助转移灶的进展。

通常情况下，黑色素瘤原位移植具有转移到肺部的倾向，因此多数使用转移性黑色素瘤模型进行治疗性实验的主要目标是肺转移。然而，笔者最近报道了可自发性转移到脑的WM239A人类黑色素瘤细胞株的变种［26］，这些细胞株的建立是由最初产生名为113/6-4L的WM239高转移性变种而来。利用该模型，已证明应用长春新碱和CTX的联合节律性化疗，可使内脏转移小鼠长期存活。在这些长期存活的小鼠中，有20%被发现存在脑转移瘤，而从这些脑转移瘤建立了两个转移细胞株131/4-5B1和131/4-5B2。这些细胞株原位移植、随后切除原发移植瘤后，可自发性地转移到脑实质，偶尔转移到软脑膜(图9-10B～E)。笔者的研究结果是首个有关人类原发瘤在小鼠体内发生自发性CNS转移，并且再注射仍可遗传学地保持其表型。这个模型可促进靶向黑色素瘤中枢系统转移的治疗研究，中枢系统转移是恶性黑色素瘤的常见表现并预后极差。

图9-10 黑色素瘤原位移植转移模型的构建

注: (A)构建高转移性113/6-4L细胞株变种和脑转移131/4-5B1、131/4-5B2细胞株模型，未经选择的人类WM239A黑色素瘤母系细胞被植入皮下，原发肿瘤长到约400mm3大小时被切除。切除后4～6个月时，取出小鼠的肺，并用于细胞培养，最终获得113/6-4L细胞系。113/6-4L细胞移植后在原发肿瘤切除6周后可导致肺部高转移负荷，原位移植131/4-5B1和131/4-5B2细胞株导致自发性脑转移。(B)113/6-4L进展期转移模型经CTX和长春新碱治疗长期存活的小鼠中，20%伴有脑转移瘤。从这些转移瘤中分离出131/4-5B1和131/4-5B2细胞株。(C)和(D)原位移植131/4-5B1和131/4-5B2导致脑实质自发性黑色素瘤转移灶的形成。(E)为软脑膜转移灶(图来源: Cruz-Munoz等［26］)。

(2) 乳腺癌

乳腺癌原位模型是将乳腺癌细胞植入到雌性小鼠的蹊部乳腺脂肪垫中，原发肿瘤可以随时用卡尺监测。使用人类MDA-MB-231乳腺癌细胞株建立的模型最为常用，该细胞系的应用具有压倒性优势(与黑色素细胞系比较)。另一广泛使用的细胞株是MDA-MB-435。然而，许多报道显示这种细胞系表达黑色素细胞标记，现在被分类为M14黑色素细胞来源的黑色素瘤细胞［55］。其他人乳腺癌细胞系模型可在体内生长，可能需要雌激素补充(如BT474)或显示非常缓慢增长(如MDA-MB-361)。此外，HER-2阳性的乳腺癌细胞(为乳腺癌最重要亚型)可能在细胞系表现为相反结果，即体内生长不良(如BT-474、MDA-MB-361)，因此妨碍体内评估HER-2靶向治疗转移性疾病的疗效。鉴于这一缺陷，笔者的实验室［56］和其他实验室［57］已构建MDA-MB-231的HER-2阳性变种(通过病毒载体转导实现HER-2的过度表达)。

(3) 结肠癌

原位结肠癌模型是通过结肠癌内注射结肠癌细胞建立的［58］。但不是很实用，主要是因为注射结肠癌细胞后难以防止盲肠壁的崩溃。如果一旦模型制备成功，肿瘤将很快生长并转移至其他器官，如肝(Man和Francia，未发表观察资料)。由于构建较难，许多研究者通过将癌细胞注入脾来构建，严格地讲属于异位移植。而这种异位移植模型被错误地定义为结肠癌原位移植模型。脾内植入人类大肠癌细胞可迅速转移到肝脏，这也印证了临床结果［49］。

与黑色素细胞瘤和乳腺癌原位移植模型不同，结肠癌原位移植模型在宿主体内生长时无法被测量。为了克服这些障碍，发展了一系列的技术，例如应用荧光素酶标记肿瘤细胞的整体生物发光显像技术［59］或者利用转染肿瘤细胞测量人尿液的促绒毛膜性腺激素蛋白［60，61］，以此监测全身相对肿瘤负荷和对治疗的反应［24］。

(4) 合理应用的相关问题

原位移植自发性转移模型似乎是研究疾病生物学性状和评估肿瘤治疗新策略的有效的理想工具。然而，从实用角度考虑，这些模型的细胞株数量是有限的。在设计这种转移模型的治疗性实验时，需要考虑多个方面:①是否真的有必要建立转移性模型。在某些特定组织如大脑，给定疗效的相关信息是否可以通过使用其他模型(如直接颅内植入)而获得。②疗法是针对原位生长的原发瘤进行测试，还是针对后来出现的转移性疾病进行测试(如后面提到的节律性口服5-FU的前体药物UFT，联合CTX治疗进展期LM2～4乳腺癌转移)。③也可能用于监测治疗期间的疾病进展。随着荧光、发光、可分泌(如HCG)标记的发展，这一个领域已取得显著进步［60］。④要考虑是应该在早期(微转移) 还是晚期(大体转移) 进展期肿瘤开展启动治疗(图9-11)。由于在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验入选的患者通常患有进展期转移性疾病，如果可能且在操作指南中可行，这种抗转移疗法疗效的临床前评估应该针对大体明确的转移灶。

图9-11 使用原位或转移性模型进行普通治疗性实验研究设计的流程

注: 设计治疗性实验的限制因素包括:①能否获得可在小鼠体内生长和转移的肿瘤细胞系。②原位移植模型的可行性(如小鼠前列腺体积小，导致原位前列腺模型技术上的困难)，而不是使用简单的皮下模型。假设原位移植是可行的，有必要引入人工替代肿瘤标记(如荧光素酶、GFP或HCG)，以便监测疾病(如大肠癌注射入脾)。③一些研究表明，对原位移植瘤无效的治疗可能对转移灶有效［12，60］。为研究转移性疾病的治疗反应，往往需要通过体内筛选转移能力足够强的亚种。④决定治疗的启动是针对微转移还是针对后来的大体转移。所有已报道的模型已被证明在节律性化疗的发展和演变中是有用的。

9.4.5 临床前肿瘤模型评估节律性化疗

(1) 节律性化疗对皮下肿瘤生长的疗效

最初的节律性化疗临床前评估多采用皮下种植Lewis肺癌。在该项研究中，Browder等［9］发现每6天一次给予大约1/3MTD剂量的CTX，总疗程超过60天，能显著抑制Lewis肺癌的增长(CTX的MTD是每21天给予腹腔注射总量为450mg/kg，每2天给药一次，150mg/kg，6天为一个周期，而节律性方案是每6天一次170mg/kg，腹腔注射)。同样，低剂量方案可以抑制采用CTXMTD剂量在体内抗Lewis肺癌变种的增长。这项研究得到另一项独立研究的支持，该研究报道每3天一次给予低剂量长春新碱(1/20～1/10的MTD)治疗，加每周两次抗VEGFR2抗体DC101(不是针对肿瘤细胞，而是靶向肿瘤微环境中VEGFR2阳性的内皮细胞)，可明显和持续地抑制SCID小鼠SK-NMC人类神经母细胞瘤的生长［15］。这个实验在治疗的开始即有长春新碱的大剂量累积(超过3周输液泵)，随后是低剂量长春新碱维持治疗。

应用皮下人类PC3前列腺肿瘤研究表明，虽然节律性CTX化疗对该肿瘤有效，预先给予单次大剂量CTX(150mg/kg)，每3周重复，可以进一步提高其抗肿瘤作用。这个改进方案的优势已在皮下注射EMT-6小鼠乳腺癌肿瘤模型以及自发诱导红白血病模型中得到证实。在这些模型中，根据不同肿瘤模型，单次大剂量注射，每3～6周重复注射［62］。这种疗法已被用于进一步的研究，包括胰腺癌的RIPTAG2模型。但是，仅应用于MTD治疗前期方案，不予重复［14］。

使用相似的治疗策略，单次大剂量CTX、随后低剂量口服CTX，用于治疗Lewis肺癌皮下瘤生长模型［63］。在野生型和TSP-1缺陷小鼠同时进行实验，显示在TSP-1基因剔除小鼠中的抗肿瘤作用不太有效。本研究显示细胞表达TSP-1作为节律性化疗抗血管生成的作用机制。这些观察提示，节律性化疗与TSP-1类似物联合有可能进一步提高节律性化疗的抗肿瘤作用，已得到许多实验证据的支持［64］。

皮下移植PC3肿瘤模型也被用于研究，证明最终发生的节律性CTX耐药不会诱发宿主CTX的药代动力学改变(如预期肝解毒酶的表达或活性变化)。此外，该模型还被用于显示节律性CTX治疗中出现肿瘤复发，当附加提拉扎明(一种靶向缺氧肿瘤细胞的生物还原活性药物)，使肿瘤细胞进一步生长延迟。总的来说，上述研究已明确节律性化疗的含义［65］，以及证实了这种治疗方法的有效性，包括原位和转移性临床前肿瘤模型。

(2) 应用原位移植和转基因鼠模型研究节律性化疗

2002年，Man等报道通过饮用水连续低剂量摄入CTX，可使小鼠原位移植乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长延迟［18］。此外，节律性CTX与抗VEGFR2抗体DC101联合可对肿瘤产生100多天的持续增长抑制。这项研究的几个重要原因是:①将CTX加入饮用水中(由此小鼠可以自行调节剂量)，大大简化了长期临床节律性化疗实验的可行性，尤其是应用CTX等可以口服的药物。②在更加接近临床的原位移植模型中，仅对原来的给药方案稍作修改(即CTX通过饮用水而不是腹腔注射给药每6 天170mg/kg)，证实Browder等得到的结果是可重复的［9］。因此，随后许多(虽然不是大多数)节律性化疗的临床试验是使用口服药物，特别是CTX。③除了MDA-MB-231以外，该疗法对许多不同的临床前模型均有效，包括人类大肠癌HT29、HCG皮下移植瘤模型(稍后讨论)、PC3前列腺癌皮下移植模型以及RIP-TAG2转基因小鼠自发性胰岛细胞癌模型。

Man等的研究报道以后，许多研究也证实其他类型肿瘤节律性化疗的效果［18］，以及测试新的药物，评估其节律性给药的疗效［3］。也试图在进展期原位移植和转移模型中，对有反应的肿瘤细胞株(如MDA-MB-231的节律性CTX治疗)重新测试已建立和验证的方案。但是，某些类型肿瘤建立原位移植模型是困难的或不切实际的，如前列腺癌。主要是因为在免疫缺陷小鼠中有效转移的前列腺癌细胞系的种类很有限，并且小鼠的前列腺体积小，难以可靠地进行肿瘤细胞原位接种。因此，在许多情况下要进行进展期疾病研究，首先要建立相应的临床前模型。下面得详细介绍建立最佳节律性化疗的进展，以及这种治疗策略在进展期转移性肿瘤模型中的应用。

(3) 节律性化疗用于进展期转移性肿瘤的临床前研究

1) 乳腺癌:人MDA-MB-231乳腺癌细胞株被用于开发多个晚期肿瘤模型，用于研究节律性化疗的作用。因此，Du Manoir等［56］通过反转录病毒转导获得HER-2阳性的变异株，被命名为H2N(图9-12)。随后，H2N细胞被原位移植到裸鼠的乳腺脂肪垫，模型被用来测试节律性CTX化疗与抗HER-2抗体曲妥珠单抗联合应用的有效性。结果表明，该组合可导致肿瘤长时间生长延缓，而且无明显宿主毒性。此外，当CTX加曲妥珠单抗联合治疗后开始出现肿瘤复发时，联合使用抗VEGF抗体贝伐单抗可进一步提高抗肿瘤作用。这些结果表明节律性CTX与靶向性药物联合(包括贝伐单抗等抗血管生成药物)，可望获得更多潜在好处。该结果已在转移性乳腺癌患者的Ⅱ期临床试验中被证实［66］。在随后的一项研究中，H2N细胞转染HCG，然后经体内筛选获得转移性变异株，称为met2［60］。met2细胞被原位接种或自发性转移生长，均采用曲妥珠单抗治疗。原位肿瘤对抗体治疗有反应，而转移灶似乎是完全抵抗。这些结果表明，仅仅研究原位原发肿瘤的生长和响应是不够的，还应关注其对已经发生的或进展期转移灶的影响［23，60］。

图9-12 基于人类MDA-MB231细胞株构建的原位和转移性乳腺癌模型用于研究新型节律性化疗方案的流程

注: HER-2基因和h CG基因插入用于制备HER-2阳性细胞变异株并表达HCG作为肿瘤生长负荷的人工标记，后者可在小鼠尿液中监测。采用体内筛选建立转移性变异株。原位移植瘤与转移灶对治疗的反应可能会有所不同(详见高转移性变种LM2-4和Met2)。

在另一项研究中，Munoz等原位移植母系MDA-MB231细胞，但肿瘤长到平均500mm3时外科切除;大约6个月后发生肺转移。汇集转移灶的肿瘤细胞进行传代培养，并用于第二轮体内筛选，获得的高转移性变异株称为LM2-4［12］。LM2-4模型被用来测试原位生长的肿瘤或晚期转移性肿瘤(手术后)对节律性化疗的响应。Munoz［12］发现CTX和优福定(UFT)两种药物组合节律性给药，可以显著延长携带LM2-4转移小鼠的生存(图9-13A)。令人惊讶的是，当该治疗开始于原位移植原发肿瘤时，无法观察到这个组合节律性化疗的显著效益(图9-13B)。在进展期自发性黑色素瘤转移模型中也观察到了类似的情况［26］。如果能在其他系统重复，这样的结果提示一个明显的忧虑，因为多数临床治疗研究常规使用或对疗法的评价限于使用皮下或原位移植瘤模型。此外，如果以原发肿瘤治疗实验获得的结果为基础，以决定是否采取进一步地在进展期转移性肿瘤模型中进行实验，上述的转移实验不可能完成。然而，通过进行平行实验揭示了其对转移性疾病的疗效——其结果对启动每2周每日节律性卡培他滨、CTX和贝伐单抗治疗转移性乳腺癌的Ⅱ期临床试验至关重要，并获得较理想的结果［66］。该治疗目前正在进行随机Ⅲ期临床试验评估，其对照组是每周紫杉醇联合贝伐单抗(根据clinicaltrials.gov的节律性化疗)。

图9-13 人乳腺癌细胞株MDA-MB231的转移性变异株LM2-4在SCID小鼠体内生长的反应

注: (A)UFT和CTX联合节律性治疗时，携带LM2-4转移灶小鼠(通过外科切除LM2-4原位移植肿瘤而建立)的生存率。(B)同样的治疗没有显著影响LM2-4原位移植肿瘤的生长。因此，仅依赖于原位肿瘤可能无法发现仅仅对转移性肿瘤有效的新的治疗方案(图来源: Munoz等［12］)。

2) 黑色素瘤:应用SCID小鼠113/6-4L黑色素瘤细胞株自发转移性模型，笔者最近报道CTX和长春新碱联合双重节律性化疗的好处。研究人员皮下移植113/6-4L细胞(黑色素瘤的原位)，当这些移植细胞长到平均500mm3大小肿瘤时即手术切除。以前认为这些条件可能导致广泛性转移(表9-3)。手术后6周，小鼠节律性使用CTX、长春新碱或两种药物联合治疗。结果对照组平均存活100天，CTX和长春新碱单一药物治疗组中位生存期分别为110天和130天，而联合CTX和长春新碱可以显著提高平均存活时间达190天，且没有任何明显毒性。这些结果表明，节律性CTX加长春新碱治疗策略是治疗黑色素瘤转移的理想疗法。

现在已经表明，CTX加长春新碱联合疗法的中位生存要好于MTD剂量的达卡巴嗪(为黑色素瘤的标准疗法)。更有研究表明，低剂量的达卡巴嗪加长春新碱和DC101抗体可明显抑制进展期转移性黑色素瘤，同时相关毒性极小。而MTD剂量的达卡巴嗪其有效性很小，毒性较高，尤其是当与其他化疗药物(CTX、长春新碱)或DC101抗体联合应用时［83］。

表9-3 研究节律性化疗用于治疗晚期/转移性肿瘤效果的临床试验

注: CR: 完全性反应; SD: 疾病稳定期; PR: 部分反应; PFS: 无进展生存期; TTP:预后生存时间; MTP: 预后平均生存期; OR: 阳性反应率; MOS:平均总生存期。

3) 结肠癌:结直肠癌模型的初步结果已经证实节律性CTX治疗可有限地控制HT29细胞原位移植的生长(Francia和Kerbel，未发表观察结果)，证实了该肿瘤皮下移植模型生长的观察结果［18］。未来研究的目的是确认节律性化疗对治疗转移性疾病是否同样有效，以及脾内注射模型与盲肠内模型(较为复杂)是否产生同样的治疗反应。

4) 卵巢癌:从笔者［84］和Merritt［85］最近的一项研究表明，每天低剂量节律性拓泊替康(Opotecan)化疗同时每天加用抗血管生成的酪氨酸激酶抑制剂帕唑帕尼(pazopanib)方案可在晚期卵巢癌模型获得强有力的抗肿瘤效果。这个方案正在准备进入Ⅱ期临床试验评估。

(4) 小结

通过应用皮下和原位移植瘤模型研究获得有关节律性化疗的有效性等重要发现［3］。此外，原位移植模型已经证明对于后续演化为转移性肿瘤模型非常重要［10，24］，这反过来又获得意想不到的发现，如节律性UFT联合CTX治疗进展期转移性乳腺癌取得令人惊讶的疗效，并且毒性极小。因此，笔者认为开发更先进的原位和转移性模型是非常必要的，这些新模型用于治疗性实验，很可能进一步促进治疗理念由实验室到临床应用的成功转化。

9.4.6 节律性化疗治疗进展期/转移性肿瘤的临床试验

已进行多个有关整合化疗药物的节律性剂量与给药方案的临床试验，用于评估这种策略对于治疗不同类型进展期/转移性肿瘤的有效性［86］(表9-3)。类似的临床试验也正在进行中，如节律性长春瑞滨联合贝伐单抗作为转移性乳腺癌的补救性治疗;节律性低剂量CTX和甲氨蝶呤联合或不联合贝伐单抗治疗转移性乳腺癌;甲磺酸伊马替尼、贝伐单抗和作为抗血管生成治疗的节律性CTX治疗转移性实体瘤(目前正在进行的节律性治疗临床试验的最新汇总表可以在http://clinicaltrials.gov中的“节律化疗”条目下找到，目前正在进行4个随机Ⅲ期临床试验)。文献中已报道的临床试验大部分为低剂量CTX或曲磷胺作为节律性化疗药物方案的基础［67，68］。

总体来讲，使用节律性化疗可有效治疗转移性疾病，且毒性很小。例如，在检测这种治疗方案治疗进展期实体瘤的一项研究中，Colleoni等［69］发现联合使用节律性CTX和甲氨蝶呤治疗乳腺癌转移患者的整体临床受益率为31.7% (包括病情稳定者)。在有反应的患者中，平均反应时间为6.8个月。这种治疗的耐受性良好(Ⅰ级白细胞减少症为常见的毒性表现)，并没有出现明显的骨髓抑制、黏膜炎、脱发，这些是标准化疗方案常见的不良反应［69］。

目前有一个想法是在节律性化疗基础上增加抗血管生成药物，作为放大这种治疗理念疗效的手段。临床前证据表明，节律性化疗与抗血管生成药物联合(如受体阻断抗体DC101或小分子抗血管生成药物) 可以增强抗肿瘤效果［3，14，15］。同样，笔者的一些临床前研究表明，节律性化疗与DC101的某些联合可有效抑制进展期转移性黑色素瘤［83］。在临床研究方面，Burstein等［70］发现在双重节拍CTX和甲氨蝶呤方案基础上加用贝伐单抗(如前所述)，较单用这两种药物的节律性组合的疗效明显增强。在最近的研究中， Dellapasqua等［66］表明，应用贝伐单抗与每日口服低剂量CTX和卡培他滨联合，有68%的患者获得疾病控制至少6个月。然而，抗血管生成药物诱导的增强效果并不总是如此。Colleoni等［71］发现合用沙利度胺(FGF-2和VEGF抑制剂)并未增强节律性低剂量CTX和甲氨蝶呤治疗进展期乳腺癌患者的疗效。然而，这一方案CTX/甲氨蝶呤(带或不带沙利度胺)导致血清VEGF平均水平明显下降和41.5%总的临床受益，同时毒性仍然很小［71］。对没有接受全身化疗与治疗的转移性肿瘤患者这种反应率可能更高(55.6%)。

9.4.7 结论

从显著延长生存时间来看，标准的MTD化疗剂量治疗进展期转移性肿瘤常常被证明无效或仅有适度的临床疗效。而且这种治疗多数被看作是姑息性治疗措施而非治愈性措施，往往伴随显著毒副作用。在此，笔者建议应该重新思考制订更有效的且毒性较小的化疗策略。为了评价节律性化疗对转移性肿瘤的疗效问题，现正由临床前和临床研究予以解决［20］。许多研究的证据显示，节律性化疗治疗晚期转移性肿瘤是很有希望的治疗策略。

当然，需要进一步评价这种方法的有效性。笔者建议应采用合理的方式进行。首先应该在进展期转移性肿瘤相关临床前模型中评价化疗组合方案(加或不加如抗血管生成等药物)的疗效，这种模型可反映肿瘤细胞从原位原发瘤到临床相关远处器官转移性播散的过程。遗憾的是，临床前治疗模型在过去50多年的临床治疗性研究中却很少应用。笔者实验室通过努力，已成功地构建了黑色素瘤和乳腺癌的这类模型，但是需要进一步构建其他肿瘤的更多模型。这些模型和方法将有助于解决在发展理想的节律性化疗中遇到的主要挑战，即决定哪种细胞毒性药物或药物组合(包括分子靶向药物)可产生最大获益［7］。临床前与临床研究人员之间的密切互动将有利于推动这些研究的进展。

(张博 译，钦伦秀 审校)

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