双向电泳和质谱技术在器官移植研究中的应用

器官移植是终末期器官功能衰竭患者最有效的治疗手段。随着手术技术的进步、组织配型技术的提高和免疫抑制药的发展，肾移植术后1年存活率已大大提高，但长期预后仍有待改善。急性排斥反应的反复发作和慢性排斥反应是引起移植物失功的主要原因，长期服用免疫抑制药所带来的毒性及副作用，如肾毒性、感染、诱发肿瘤等，亦影响移植物及受者的长期存活。

蛋白质组学已作为诊断工具广泛地应用于癌症研究中，尤其是用于癌症早期无创诊断的标记物筛选。移植蛋白质组学研究正如火如荼地展开来，主要集中于急性排斥反应无创诊断标记物筛选，免疫抑制药的肾毒性研究和肾移植术后感染的研究中。

1．急性排斥反应的诊断　移植排斥反应的早期无创诊断显然对于抑制物的长期存活有着重要的意义。目前对移植肾急性排斥反应的诊断包括临床症状、体征以及生化指标等，但这些方法往往在急性排斥反应的晚期才能发现问题，移植肾活检也只能反映移植肾的局部情况，而且还有一定的并发症如血尿、移植肾破裂等。目前国际上仍缺乏移植排斥反应的无创诊断和预警体系。蛋白质组学的发展为移植排斥反应的诊断标记物的筛选提供了良好的技术平台。

O′Riordan等应用SELDI－TOF　MS等蛋白质组学技术对移植肾排斥反应患者与移植肾功能稳定组的尿液进行对比分析，发现4．7ku的β防卫素1（beta－defensin－1）和4．4ku的α－1抗胰凝乳蛋白酶（alpha－1－antichymotrypsin）可作为候选标记物诊断急性排斥反应。Schaub等应用质谱分析技术，通过对比分析若干组移植受者（包括移植物功能稳定组、急性排斥组、急性肾小管坏死组和复发性肾炎组等）或健康人的尿样中的蛋白，发现94%的移植排斥患者尿样中含有3个显著峰群（peak　clusters），仅有17%移植物功能稳定的患者的尿样中含有这些峰群，而健康对照组、急性肾小管坏死组和复发性肾炎组尿样中则不含这些峰群。通过进一步的研究，Schaub发现这些峰群来自于被剪切的β－2微球蛋白，并分析出剪切出完整的β－2微球蛋白需要尿液的pH＜6，并且尿液中必须同时存在天冬氨酸蛋白酶。这些研究提示，移植肾急性排斥患者的尿液中剪切的β－2微球蛋白的含量增高。Wittke等通过毛细管电泳－质谱（CE－MS）技术，发现尿中有一种多肽在急性小管间质性排斥反应中显著异常，而在急性血管性排斥反应中没有这种现象。浙江大学应用双向电泳对比研究了大鼠肝移植排斥反应的移植肝脏的蛋白表达谱，发现了27个肝移植排斥反应组升高的蛋白质，并通过MALDI－TOF　MS鉴定了其中的19种蛋白质。

应用蛋白质组学技术对肾移植患者的血清和尿液进行分析研究是筛选急性排斥反应的标记物，进而预警、早期诊断急性排斥反应和判断患者预后的重要手段。

2．免疫抑制药的肾毒性研究　Aicher等应用2D－PAGE方法发现，环孢素对肾移植患者肾血管和肾小管的毒性作用可以引起肾内一种28ku的钙结合蛋白的表达水平降低。用2D－PAGE和质谱技术对肾脏皮质、髓质细胞中的蛋白质进行分析，有助于对肾脏功能的了解，特别是对药物毒性在肾脏内区域敏感性的研究很有帮助。

3．肾移植术后感染的研究　CMV感染是肾移植术后常见的并发症之一，其活动性感染的发病率在30%～75%。Susan等用MS／MS发现了人巨细胞病毒12种新的蛋白质。病毒体的主要蛋白是pp65壳蛋白，主要糖蛋白是糖蛋白M，同时在病毒体内还发现了70种宿主细胞的蛋白质，包括细胞结构蛋白、酶等。这些发现为CMV感染机制与治疗方法的进一步研究提供了方向。

4．移植物抗宿主病的研究　造血干细胞移植（hematopoietic stem　cell　transplantation，HSCT）是治疗许多癌症和非肿瘤疾病的有效手段。但是移植物抗宿主病（graft　vs．host　disease，GVHD）依然是HSCT后最主要的并发症。Kaiser等应用毛细管电泳－ESI－TOF　MS对35例同种异体干细胞移植，5例自体干细胞移植和5例败血症病人尿液的标本，进行了尿蛋白质谱分析，并设立健康对照。结果显示，干细胞移植病人与健康对照相比，有21种多肽具有显著差异，特异性95%，敏感度100%。同时，他们还发现，干细胞移植后发生GVHD组和未发生GVHD组病人尿液中有有16种多肽显著不同，特异性82%，敏感度100%。发生GVHD组多肽的表达比出现临床症状早5～15d。应用MALDI－TOF／TOF　MS，两个在GVHD组表达升高的多肽被鉴定出来，白细胞三烯A4水解酶和白蛋白。

以上研究及既反映了移植蛋白质组研究的优势，同时也显示了其中的不足。上述研究的共同点在于，筛选无创的早于临床表现的诊断标记物，同时，这些研究都找到了一些研究相关的蛋白质峰。但是，没有一个研究设立专门的课题对他们的实验结果进行验证。因此，实验结果始终未能应用于临床，从而未能使病人从中受益。但是，我们能够由此看到移植蛋白质组学研究的良好应用前景。