酶联免疫吸附试验在器官移植研究中的应用

1．人巨细胞病毒的检测　近年来随着器官移植技术的成熟和广泛开展，移植后受体发生HCMv感染的概率也相应增大，HCMV感染已成为器官移植失败的重要原因之一。因此，早期、快速、准确地诊断和监测HCMV感染对抗病毒治疗有重要临床价值。目前对于HCMV感染的诊断和监测主要依赖于实验室检查，近年来虽然新开展了核酸序列扩增法（NASBA）测mRNA以及基因芯片等新技术，但应用最为广泛的3种方法是ELlSA检测抗体IgM免疫组化法检测p65抗原血症、FQ－PCR检测HCMV DNA。有研究者对这3种方法进行了比较。比较结果得出：ELISA的阳性检出率较其他2种方法低，为7．4%，而且在9例HCMV病中，ELISA测得阳性例数为3例，其敏感性并不高，为3．3%，但是其在特异性和阴性预测值中并不低，分别为95．0%和94．0%，3种方法的特异性和阴性预测值之间差异无显著性（P＜0．05）。在测得的3例阳性中，无一例在临床症状出现前被检出，可见ELISA在检测时间上并无优势，因此，ELISA不能为临床早期诊断HCMV活动性感染提供有效依据。这是由于HCMV抗体一般在感染1周至数周后才能出现，加之在肝移植患者这个特殊的群体中，术后接受大剂量的免疫抑制药物治疗，在免疫抑制状态下，抗体的产生可能延迟或缺乏。因而，ELISA虽然简便快速，缺点是感染后不能较早地检测出HCMV抗体，限制了其在肝移植术后HCMV活动性感染早期诊断中的应用。但其可作为供、受体是否感染过HCMV的筛选指标，并可以反映机体的免疫反应状态，了解机体对HCMV感染的防御能力。

2．细胞因子及其受体测定

（1）白细胞介素－2（IL－2）及其受体：IL－2是免疫网络中起中心调节作用的最为重要的淋巴因子之一，在机体免疫应答、免疫调节和肿瘤免疫中具有重要作用。器官移植早期排斥反应IL－2水平升高。sIL－2R是由细胞分泌或从细胞膜表面脱落的IL－2R的A链，在淋巴细胞激活的早期释放，是淋巴细胞活化的可溶性标志，监测肾移植术后sIL－2R的变化有助于了解机体的免疫状态。正常人血清中可检出一定量的sIL－2R。肾移植术前测定血清sIL－2R水平明显高于对照组，可能与长期行血液透析治疗，使免疫系统功能紊乱、肾脏排出受阻等原因有关。肾功能稳定组患者由于应用CsA抑制了淋巴细胞的增殖、IL－2的释放和sIL－2R的表达，皮质类固醇激素也抑制了细胞毒T淋巴细胞与淋巴细胞活性杀伤细胞的增殖，使血清sIL－2R含量迅速下降；2～3周后血清sIL－2R水平有所回升并趋于稳定，与血肌酐的变化有明显的一致性。当机体出现急性排斥反应时免疫活性细胞大量浸润，受异体抗原的激活sIL－2R大量释放，血清sIL－2R水平明显升高，与肾功能稳定组相比差异显著。血清sIL－2R比临床症状出现及血肌酐、尿素氮升高提前1～3d，为临床诊治争取了时间。由于甲泼尼龙的抗炎和免疫抑制作用，冲击治疗有效者血清sIL－2R迅速下降，3～5d后恢复至肾功能稳定组水平。而难治性排斥反应患者，采用OKT3冲击第2天sIL－2R短暂上升，但随后迅速下降，7～10d后恢复至稳定组水平。感染时免疫系统功能增强，血清sIL－2R含量增加，与排斥反应组比较无显著性差异。但在急性排斥反应时sIL－2R及血肌酐、尿素氮均升高，并出现尿少、移植肾区肿痛不适等临床症状，感染时仅以sIL－2R升高为主，因而可将两者鉴别。CsA中毒可导致移植肾功能减退，通过外周血sIL－2R的测定可有效地区分急性排斥反应和CsA中毒所引起的肾损害。CsA中毒时以血肌酐、尿素氮升高为主，CsA血浓度多数在400ng／ml以上，而sIL－2R无明显变化，因此，sIL－2R可区分排斥反应及非免疫因素引起的肾损害。

（2）白细胞介素－6（IL－6）：急性排斥反应是肾移植术后最常见的一种排斥反应，其机制主要是细胞免疫应答。随着HLA基因配型技术的广泛应用和新型高效低毒免疫抑制药物的不断出现，肾移植的近期成功率有了很大提高，但手术后急性排斥反应仍有一定的发病率，并且急性排斥反应是导致远期移植物丢失的一个重要危险因素。如果在术后能早期发现或预测急性排斥反应的发生，对于早期治疗或者提高移植物的远期存活率，均具有重要意义。目前对急性排斥反应的诊断还主要局限于临床症状。急性排斥反应本质上是一种移植物诱发的急性免疫反应过程，从发生到临床反映出来，需要一段时间，临床发现急性排斥反应的时间要晚于其实际发生的时间，治疗比较被动。肾脏穿刺活检虽然十分准确，却有创伤性，时机亦不好把握，开展有困难。因此，发掘新的、便于检测的特异性分子标志物，建立无创预测诊断体系，及时，有效地预警移植物排斥反应已成为器官移植学界迫切需要解决的问题。IL－6是细胞因子和其他系统调节因子复杂网络的重要成分，具有广泛的生物学活性。1991年Yoshimura等研究显示，IL－6可作为移植肾排异和肾毒性反应的鉴别工具。有研究者对37例肾移植受者和55名正常人血清IL－6水平的动态测定结果表明，移植肾急性排异患者血清IL－6水平明显升高，而慢性排异患者IL－6水平无显著变化，提示血清IL－6水平监测是移植肾排斥反应的重要诊断指标之一。2003年，Mahmoud等发现尿液中的可溶性IL－6受体可作为慢性肾移植排斥反应的预警指标。

（3）肿瘤坏死因子α（TNF－α）：TNF－α是一种炎性细胞因子，来源于多种细胞，如单核巨噬细胞、NK细胞、T细胞等。TNF－α在肾移植急性排斥反应中尤为重要。国内外许多研究显示，发生急性排斥反应时，血TNF－α水平升高，而应用针对TNF－α的抗体免疫治疗使移植动物模型的存活时间延长1倍TNF－α在急性排斥反应中的作用还体现在可诱导黏附分子表达，从而促进白细胞与内皮细胞之间相互作用；介导淋巴细胞与APC之间相互作用，激活T细胞分化为效应细胞；介导淋巴细胞与靶细胞之间的相互作用，产生细胞介导的细胞溶解反应。

（4）ICAM－1：ICAM－1是一种多功能细胞黏附分子，在肾脏移植免疫应答过程中起着重要作用，参与抗原提呈、白细胞浸润移植物的级联反应、白细胞跨越细胞外基质和效应细胞与靶细胞之间的相互作用等，它的表达受细胞因子的调控，ICAM－1（CD54）主要分布于内皮细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、树突状细胞和管状上皮，与整合素家族LFA－1及Mac－1相配起作用。有研究发现，急性排斥发生时血清sICAM－1浓度升高，并先于排斥反应1～2d发生。肾移植术后血清sICAM－1浓度在使用免疫抑制药后均有不同程度的降低，发生排斥反应后2dsICAM－1浓度有所升高。

（5）白细胞介素－10（IL－10）：IL－10是一种免疫抑制因子，主要由Th2细胞分泌，对Th1细胞克隆产生的细胞因子起抑制作用。IL－10的主要效应是抑制活化的单核巨噬细胞产生的IL－1，IL－6和TNF－α，IL－10对Th1及Th2的抗原特异性增殖、细胞因子分泌都有下调作用。为证实IL－10在肾移植中的免疫抑制作用，运用反转录聚合酶链反应分离98例肾移植标本的RNA鉴定细胞因子mRNA的表达证实，移植肾内IL－10mRNA和IL－2mRNA表达与急性排斥反应明显相关；IL－10不能阻止体内干扰素γ，IL－2，IL－7或转化生长因子（TGF）－β的表达。此研究首次提出移植肾内IL－10mRNA的表达和急性肾移植排斥呈显著正相关，提示限制IL－10的表达在预防同种肾移植的急性排斥反应中可能有治疗作用。此结论对于目前普遍将IL－10描述为一种免疫抑制因子是一个挑战，需要做进一步的体内研究以明确IL－10这一多功能多肽的免疫调节作用。

（6）sCD30：人类CD30分子属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，CD3O主要表达于分泌Th2型细胞因子的T细胞，当CD30＋的细胞活化后，其胞外成分释放入血，形成血清可溶性CD30（sCD30）。肾移植受者术前sCD30水平和术后移植肾急性排斥反应（AR）发病率具有较强的相关性。Pelzl等研究显示，肾移植术后3～5d监测血清sCD30可鉴别诊断急性排斥反应与急性肾小管坏死及其他复杂情况。一些研究显示，血清中的高水平sCD30与移植物排斥或失功相关，提示sCD30可作为移植物功能预后的判定标准。

（7）肝细胞生长因子（HGF）：肝细胞生长因子（HGF）又名scatter因子，属于可溶性细胞因子家族，最初是作为一种对成熟肝细胞有明显促生长作用的细胞因子而被发现。近年研究表明，HGF在器官移植中有重要作用，对排斥反应的诊断及抗排斥反应疗效的评价具有重要意义。