干扰及其技术在器官移植中的应用

1998年Andrew　Fire和Craig　Mello发现双链RNA（doublestranded　RNA，dsRNA）可以抑制线虫同源基因的表达使基因沉默，并且沉默可遗传给子代，现将这类小干扰RNA分子（small interference　RNA）可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的现象称为RNA干扰（RNA interference RNAi）。因其用于基因治疗的有效性，目前科研人员已经将RNAi技术应用于基因功能、抗病毒、抗肿瘤、器官移植方面研究取得了可喜的成果。《Science》杂志将RNAi评为2002年度和2003年度十大科学成果之一。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，2006年度诺贝尔生物学或医学奖授予Andrew　Fire和Craig　Mello，以表彰他们发现RNA干扰现象。RNAi技术作为一种有效的基因表达干预手段在生物学及基础医学中已被广泛应用。

器官移植是多种器官终末期疾病的有效治疗手段。手术技术的改进、器官灌注与保存、HLA配型和免疫抑制药的联合使用，极大地提高了移植物的存活率和存活时间。但长期非特异性的免疫抑制药造成明显的发病率和病死率，特别是引起感染和恶性肿瘤。如果能实现供者特异性的免疫抑制而同时完整保留免疫系统的全部功能，就能避免因为长期使用非特异性免疫抑制药物带来的诸多问题。在器官移植实践中，以T淋巴细胞为中心介导的排斥反应是威胁器官移植患者生命的主要危险因素。患者术后必须终身服用免疫抑制药物控制移植排斥。这些免疫抑制药只是相对特异性的，在控制移植物排斥的同时造成受者机体免疫力低下，各种机会感染随之而来，受者要面临发生致死性感染和肿瘤等的危险。控制移植物排斥最理想方法是诱导受者产生对供者的特异性免疫耐受。RNAi技术因可以高效沉默特定基因，去除移植过程中不利基因的表达，在器官移植方面具有广泛的应用前景，它抑制排斥反应的发生，诱导受体免疫系统对异体器官免疫耐受，减少抗移植排斥反应的免疫抑制药物的应用。RNAi技术主要通过两个途径实现：①针对T细胞免疫反应关键因子的表达，如细胞因子受体特定亚单位β链，信号传递信使和转录活化因子－4（STAT－4），以及T－bet等；②针对抗原提呈细胞作用过程的相关基因沉默，如共刺激因子CD80，CD40，CD86，IL－12等。研究显示，阻断供体树突状细胞的CD80和CD86基因表达能使小鼠心脏移植物和大鼠肝脏移植物存活时间明显延长；Martin等研究发现，输注CD40基因敲除小鼠的树突状细胞可诱导抗原特异性免疫耐受；Adams　AB等研究发现，嵌合型的抗CD40单克隆抗体能与LEA29Y协同作用，延长移植物的存活时间并能避免CD40／CD154相关处理所带来的血栓栓塞等问题。Pluvinet等报道已成功地设计、合成出人CD40siRNA，并通过体外细胞转染实验证实其可在mRNA和蛋白质水平有效抑制细胞CD40基因表达，通过此途径可能会诱导受体免疫系统产生对异体器官免疫耐受。Hill等将针对IL－12p35的特定siRNA转染树突细胞，可在不影响其他基因表达和细胞生存的前提下有效抑制IL－12p70的活性，而IL－10生成增多使得Th1／Th2细胞因子平衡向Th2细胞因子偏离，促进了免疫耐受的形成。另外，许多封闭共刺激作用的实验方法都能有效延长同种移植物存活并诱导耐受。CTLA4－Ig是第一个显示能延长同种异体和异种移植物存活的共刺激作用封闭分子。CTLA4－Ig是CTLA4的胞外段与人IgG1Fc段融合形成的融合蛋白。CTLA4－Ig与APC上表达的B7－1（CD80）和B7－2（CD86）的亲和力高于T细胞上表达的CD28与B7和B7－2的亲和力。CTLA4－Ig的作用是抑制CD28介导的T细胞共刺激作用。在缺乏CD28信号下，T细胞的激活诱导特异的无反应性。Xu　KL等运用RNAi技术，成功地设计、合成出与CD28基因片段相关的siRNA，并对人淋巴细胞进行体外转导，最后检测发现所导入siRNA能有效减少CD28和CD28mRNA的表达。说明由siRNA介导的CD28mRNA沉默同样能达到阻断共刺激通路的作用。

人体器官短缺现在是世界器官移植界面临的一大难题，猪器官作为供体型异种移植给人有可能解决供体器官短缺的问题。但猪器官内的逆转录病毒（PERV）可能诱发肿瘤和免疫缺陷因而限制了其应用。Karlas等针对PERV基因设计合成特异性siRNA，将其导入PERV感染的人肾293细胞中，结果发现siRNA可有效抑制PERV基因的表达，PERV的细胞外释放量明显减少，认为此项技术增加了异种器官移植的安全性。各种器官移植术后继发的机会性病毒感染亦可以应用RNAi高效特异的抗病毒作用予以治疗。异种移植的进步，给器官移植供体的严重短缺提供了新的解决途径。然而人们仍将面临超急性排斥反应的难题。超急性排斥反应由人的异种反应性IgM与猪器官内皮细胞结合而启动。90%以上与猪器官结合的异种反应性抗体针对Gala1－3Gal。Gala1－3Gal特异性反应性抗体属于一个包括同种型血细胞凝集素（isohemagglatinins）在内的抗体家族，占循环IgM的1%～4%。一旦与内皮细胞表面的糖蛋白和（或）糖脂上的Gala1－3Gal结合，这些抗体便激活补体，启动破坏新植入器官的系统反应。2005年Min　Zhu等首次成功利用RNAi技术抑制猪a－Gal的表达，有效地保护了内皮细胞免受补体介导的细胞毒性作用。

同时，RNAi技术可能减弱缺血及再灌注损伤中相关基因的表达，如Bax、Fas、caspase、TNF－α等，这可以减轻移植体的损伤，提高移植手术的成功率。实验显示，caspase－8siRNA，caspase－3 siRNA及Fas　siRNA可分别减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤和小鼠同种异体移植肝细胞的凋亡，而且应用RNAi技术可抑制移植过程中的病毒复制。