流式细胞术的特点及在器官移植中的应用

流式细胞术（flow cytometry）是20世纪70代初发展起来的一项高新技术，80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。流式细胞术是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。其特点是：第一，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以进行分析；第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞；第三，同时测量每个细胞的多参数特征，包括该细胞的光散射和荧光指标，分析其体积、内部结构、DNA，RNA及蛋白质、抗原等物理及化学特征；第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些试验。流式细胞术具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等，其检测速度之快统计学精度之高，是其他方法无法比拟的。在基础研究中，流式细胞术可以研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜到胞浆和核内物质及染色体，还可以探讨不同物质之间的关系。作为常规实验诊断的重要手段，为临床提供了大量重要的诊断依据。

现如今，流式细胞术又广泛的应用在器官移植领域中。器官移植作为一种行之有效的治疗方案，已经广泛地应用于临床医学之中，并为很多看来已经“无药可医”的疾病拓展了一个很广阔的治疗空间。然而，器官来源的缺乏和诸如移植物排斥、移植物抗宿主病和原发病的复发等复杂因素还严重地威胁着患者和移植物的存活期。为解决这一难题，科学家们一直在致力于解决以下两方面的问题：最佳的供者与受者的组织配型；改善移植后患者的维持治疗，其中包括新的免疫抑制药的应用和对移植排斥状态的实时监控。而流式细胞术恰恰是在移植前后为同种异体移植的受者提供了一个较传统方法更为灵敏的监控方法，主要包括两个方面：检测受者血清中抗供者的anti－HLA抗体；监测移植期间受者的免疫状态。

1．在组织交叉配型、HLA－I类和Ⅱ－类特异性抗体的筛查的应用　在器官移植中流式细胞术交叉配型（flow cytometry crossmatching，FCXM）技术已成为一种快速、灵敏和特异的检测方法，一个非常有效的判断供者与受者之间配型是否恰当的工具。而最早的交叉配型方法之一的补体依赖淋巴细胞毒试验交叉配型（complement－dependent cytotoxicity crossmatch，CDC－XM），即：供体淋巴细胞与选择的受体血清混合起来，与补体一同孵育，通过染色区别死亡细胞，而细胞死亡的程度可决定CDC－XM是否阳性。尽管CDC－XM阳性对于一些急进型排斥反应有一定价值，但CDC－XM阴性却不能确认为抗体不存在和保证移植物的长期存活。有文献报道几例CDC－XM阴性的患者，肾移植后发生了超急性排斥反应，对减少超急性排斥反应、提高移植物的存活具有一定意义，并且因为CDC只能检测补体结合的抗体，无法确定抗体种类是IgG还是IgM，而影响移植效果的是特异性IgG抗体，因此，CDC－XM并不能完全预防超急性排斥反应的发生。FCXM比CDC－XM敏感116倍，并可特异性的多参数定量测定，不仅检测补体结合的抗体，也检测非补体结合的抗体，因此FCXM与CDC－XM相比，有了相当大的优越性。

在FCXM中，供者细胞同受者血清混合，代替补体的是标记了荧光素的抗人免疫球蛋白。如果抗供者抗体存在，它们就将同淋巴细胞结合，使得标记的荧光强度加强。用流式细胞仪多参数分析就可以区别出哪一种淋巴细胞亚型是阳性（T细胞或B细胞），同时识别特异抗体的种型（IgG或IgM）。例如，我们用FITC　anti－human－immunoglobin、PE－CD20和PerCP　CD3三色抗体，就可以同时区分出T细胞和B细胞。若受者血清上对供者CD3细胞发生反应，则表明非－HLA抗体存在，因为已知HLA或排斥反应相关抗原不会只存在于T细胞。因而，这样的配型就不会成为移植禁忌证。相反，一个血清既同CD3反应，又同CD20反应，则预示至少有anti－HLAI型抗体存在。这样，FCM检测移植抗体因其同CDC－XM相比更好的灵敏度而在临床有了越来越多的应用。

2．监测器官移植术后病人的免疫状态　免疫表型检测：尽管超急性抗体介导的排斥反应可以被移植前抗体检测所避免，但患者仍然面临着细胞介导的移植物排斥反应。突然的移植物功能丧失往往表明T细胞介导的急性排斥反应的发生。如果能够早期诊断，急性排斥反应往往能够成功地运用免疫抑制药（诸如咪唑硫嘌呤、类固醇制剂等）而得到控制。因此，移植后患者免疫球蛋白的监控，就成为在移植物出现明显的损伤之前早期预测排斥反应的一个很重要的方法。几年来，科学家们监测CD4（即辅助性／诱导性）和CD8（细胞毒性／抑制性）T细胞亚群来监控肾移植受体的免疫状况。早期研究表明，CD4／CD8比值同移植排斥反应有关。进而研究发现，排斥反应往往发生于CD4／CD8比值低下的患者中。然而，也有一些学者认为，CD4／CD8比值与排斥反应没有直接关系，不同的研究结果争执不下源于CD4和CD8亚群的种型多样性（heterogeneity）。例如，CD8可分为抑制型和细胞毒型，还有部分NK细胞亦表达CD8抗原。同样，CD4也可根据CD29和CD45的表达分为成熟型和处女型，既使是区分了各种亚型，CD4及CD8同移植排斥反应的关系仍不明显，还有待于进一步研究。

免疫表型的分析包括淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态（淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的大细胞群，在免疫应答过程中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群。当亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。流式细胞术可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开来，并计算出它们相互间的比例，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，并指导治疗。

活化总T细胞：CD3＋／HLA－DR＋。

静止总T细胞：CD3＋／HLA－DR－。

活化CD4＋细胞：CD4＋／HLA－DR＋。

活化CD8＋细胞：CD8＋／HLA－DR＋。

活化诱导分子：CD69。

IL－2低亲和力受体：CD25测定－CD25＋／CD3＋，反映活化T细胞，CD25－／CD3＋，反映静止T细胞。

调节性T细胞不仅自身不增殖，且能抑制其他效应细胞的应答和繁殖。其中的一类天然调节T细胞，在胸腺和外周均有生成，主要标志有CD4和CD25及CD45RBlow。它在诱导自身耐受、维持T细胞自稳、防止自身免疫病以及抗移植排斥中起着重要作用。其机制可能通过细胞间直接接触和／或抑制性细胞因子。现已证实人体内存在这种细胞。

调节性T细胞是来源于胸腺的CD4＋T细胞，并且组成性表达IL－2受体的α链（被命名为CD25），抗CD25单克隆抗体可与表达于同种异体抗原活化的T细胞表面的IL－2结合，临床经验证明可以减少急性排斥反应，诱导移植物免疫耐受。具有免疫抑制功能的调节性T细胞在移植物免疫耐受的诱导和维持中起着关键作用，有研究显示，移植物移植前或移植后清除调节性T细胞可以导致已经耐受的移植物发生急性排斥反应。我们研究曾发现临床移植受者应用anti－CD25mAb后，外周血CD25＋T细胞显著减少。另有研究证明，CD25在活化T细胞中表达，但其在活化的T细胞表达水平较低，而Treg经TCR激活后持续表达高水平的CD25，近期的研究将表达高水平CD25的CD4＋T细胞、CD4＋CD25high这群细胞定义为Treg细胞。Baecher等研究证实控制Treg发育及其功能效应的关键因子－FoxP3（forkhead　box protein　P3，叉头翼状螺旋转录因子）；同样有研究将FoxP3mRNA及其编码蛋白Scurfy（简称Sf）定义为Treg鉴定标记。

BD　Biosciences和其他实验室结果显示，人类调节性T细胞可通过CD127低表达进行识别。它的表达与FoxP3表达极其一致，并且与CD4细胞中等、高表达CD25也相一致。这个标志明显优于检测胞浆内FoxP3检测方法，适用于体外培养与分析。另一优点在于使用些标志进行分选所得的T调节性细胞得率明显增加。而使用高表达CD25方法识别调节性T细胞进行分选，其得率往往在0．6%～7．9%。使用低表达CD127联合CD25，结合我们的设门方法可获得CD25低表达的调节性T细胞，从而提高了分选得率。这种方法使得调节性T细胞的得率提高2～4个数量级而不含有CD25中等表达的非调节性T细胞（彩图5）。

【主要试剂】　CD4－FITC；CD25－PE及同型对照IgG1－PE，溶血素。

【实验步骤】

（1）取肝素或枸橼酸钠抗凝血2ml，室温放置，6h内处理。

（2）样品染色：取2支试管，每管加入100μl全血，Ⅰ为阴性对照管，Ⅱ为实验管CD4－FITC＋IgG1－PE，CD4－FITC＋CD25－PE。

（3）按上述的加入相应量的抗体，室温避光15min。取出试管，每管加溶血素2ml。室温避光10min。待红细胞全部溶解，1　200r／min，离心5min，弃掉上清后（注意一定要快速垂直倒掉），每管加入2ml的PBS缓冲液洗细胞2次，1　200r／min，离心5min。弃掉上清。最后，每管加入0．5ml的PBS，放4℃冰箱，4h内上机检测。

【注意事项】　流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本的制备过程中出现人为非特异性荧光干扰（尤其在间接免疫荧光染色中）或细胞浓度低等检测结果。解决这些影响因素的方法如下。

（1）处理完标本后，尽量4h内上机检测，如不能及时上机要放在1%多聚甲醛固定液中保存，72h内上机。

（2）确保标本上机检测前的浓度为1×106／ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。

（3）使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0．5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

（4）荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。

（5）设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

（6）判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更准确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

（7）注意在冷环境下操作染色，或加入叠氮钠，保证细胞免疫荧光定量分析精确和稳定。

（8）标本保存，免疫荧光染色后，标本不固定可以在4℃避光情况下保存24h。时间更长则需要固定保存，常用的固定剂为1%～4%多聚甲醛缓冲液或4%甲醛缓冲液（pH　7．2），固定时间可达到2～3周。