色谱-质谱联用技术

色谱可以将复杂的混合物中的各个组分分开，但它的定性、定结构的能力较差；而质谱对未知化合物的结构有很强的鉴别能力。色谱-质谱联用技术把色谱技术强大的分离能力与质谱技术有效的分析能力高效结合，为复杂体系的分离分析提供强有力的技术平台。

色谱-质谱在线联用的基本技术是将色谱仪和质谱仪通过接口连接起来。经色谱仪分离后样品中的各组分，通过接口变成适应质谱仪的真空环境后，进入质谱仪进行分析，色谱和质谱分析几乎同步完成。该技术发展较早，使用比较广泛，主要包括气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、毛细管电泳色谱-质谱(CEC-MS)联用等。

(一)气相色谱-质谱联用

气相色谱法(GC)是以气体为流动相的一种色谱法，在气相色谱仪操作许可的温度下，能直接或间接气化的有机物，均可用GC进行分析。样品分析一般可在20～30s完成，具有分离效能强、灵敏度高的特点，适合进行有机化合物的定量分析，但定性分析比较困难。GC-MS联用可对复杂的混合样品进行分离后再进行定性、定量分析。目前，该技术比较成熟，已经成为分析有机混合物的强有力的技术。GC-MS联用如图9-5所示。

图9-5　GC-MS联用

GC-MS联用技术应用广泛，可以用于环境污染分析、食品香味分析鉴定、医疗诊断、药物代谢研究和毒物分析等，尤其在医学、药物检验中发挥着重要作用，包括药物成分含量分析、质量控制分析、中草药及中成药中某些成分的鉴定、体内药物监测、疾病诊断、临床监测、生物大分子(蛋白质、肽类、多糖、核酸等)鉴定分析等。宋元宗等利用GC-MS分析了鸟氨酸氨甲酞基转移酶缺陷症尿液标志物，结果发现患儿尿液中有明显的乳清酸、尿嘧啶和乳酸信号，是该病诊断过程的一个突破。可见GC-MS在OTCD等遗传代谢病的诊治中具有一定的应用价值。王红等利用GC-MS法成功检测动物肝脏组织中的盐酸克伦特罗，并提出，与传统方法相比该方法具有简便、定性定量准确等优点。GC-MS也被国际奥林匹克委员会定为进行药检的重要技术之一。

但是气相色谱要求样品有一定的蒸气压，只有20%的样品可以不经过预先的化学处理而能用GC分离得到满意的结果，多数情况下所研究的药物需要经过适当的预处理和衍生化，使之成为易气化的样品后才能进行GC-MS分析。因此，气相色谱不能用于极性强、挥发性强、分子量大及不稳定的混合体系的分离。

(二)高效液相色谱-质谱联用

高效液相色谱(HPLC)在复杂样品分析中显示很高的分辨率，而且定量准确，但其定性分析能力差。高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用相互补充，可以对复杂样品进行定性和定量分析。而且液相色谱(LC)不受样品挥发度和热稳定性的限制，克服了气相色谱不能用于极性强、挥发性强、分子量大及不稳定的混合体系分离的缺陷，因此LC-MS联用适用于分子量较大、难气化、易挥发或对热敏感的物质以及离子型化合物和高聚物等的分离分析，是目前使用最为广泛的一种联用技术。LC-MS联用如图9-6所示。

图9-6　LC-MS 联用仪

MALDI和ESI是质谱中研究蛋白组学最主要的“软电离”技术。HPLC-MALDI主要应用于气化和电离简单的多肽样品，使其可以用于快速的质谱分析；HPLC-ESI主要用于分析复杂的肽段混合物(分子量<1 000)。

HPLC-MS联用样品制备简单，回收比较容易，适合于样品的大量制备，在生物化学(多肽、核酸结构分析)、环境科学、药物研究等领域中得到了广泛应用。①在药物及其代谢物分析中的应用:主要用于复杂混合物分析、天然药物提取物分离鉴别、药理作用考察、指纹图谱分析和药物代谢等。Yoshitom等用LC-APCI-MSMS联用对血浆中维生素K同类的VK1、VK4和VK7进行定性和定量研究，结果显示该方法在复杂药混合物分析中的灵敏度高、精确度高和准确度高等优势。李松林等用反相高效液相色谱-紫外-质谱对川芎药进行指纹图谱分析，阐明不同产地药材的异同性，为建立川芎药的质量标准奠定了基础。②在生物大分子分析中的应用：主要包括多肽、蛋白质、多糖、核酸等的分析。Spah等用HPLCMS/MS(Q-TOF)对商业收集的男性尿液进行了4次分析，采集了1450个MS/MS谱图，匹配了751个序列，鉴定了124种蛋白质。Cunsolo等将RP-HPLC-ESI-MS用于花粉中引起过敏的蛋白质中二硫键的确定以及所含半胱氨酸氧化态的表征，为蛋白质和多肽中二硫键的研究提供了一个新的方法。基于LC-MS的蛋白质分析技术如图9-7所示，但是由于HPLC设备较昂贵，且柱填充剂和流动相较贵，该技术在普及应用中受到一定的限制。

图9-7　基于LC-MS的蛋白质分析

(三)毛细管电泳色谱-质谱联用

毛细管电泳色谱(capillary electrochromatography，CEC)是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相，用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法，是高效液相色谱法(HPLC)和高效毛细管电泳(HPCE)的有机结合。CEC克服了液相色谱中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展的问题，兼具液相色谱的选择性，具有分离速度快、柱效高、样品和试剂用量少等特点，与质谱能提供精确分子量和结构信息、灵敏度高以及专属性强等优点相结合，可快速准确地进行样品的定性、定量分析。CECMS联用如图9-8所示。

图9-8　CEC-MS联用

CEC-MS在分析检测和研究的许多领域，特别是在有机化合物常规检测工作中起着重要作用，被广泛应用于生物样品分析、生物反应研究、药物分析等多个领域。在生物样品分析中被广泛用于染料、金属离子、血浆、肽、甾类化合物药物、核苷酸、核苷酸添加物以及氨基酸等样品的分析。Rentel等利用CEC-MS对不饱和脂肪酸酯、维生素D2和D3以及4种不同的雌激素进行了分离检测。Jim等采用CEC-MS研究生物大分子与有机小分子配体的结合作用，通过扫描有机小分子库可以迅速、准确地表征与生物大分子在特定的位点有亲和力的有机小分子。Paterson等采用CEC-MS联用技术对血浆提取物中与候选药物母体结构相关的13种化合物进行了定量分析。

但是CEC存在着诸如产生气泡、填充柱易断、检测灵敏度低、填料种类有限等问题，特别是在分离大分子生物样品如DNA、蛋白质时，尚存在方法匮乏、重复性差等现象。因此CEC-MS要得到广泛应用还是一个具有挑战性的课题。

(四)多维色谱与质谱联用

多维色谱是基于两种或两种以上不同分离机制方法的优化和组合，采用多种不同的液相分离模式之间或液相分离模式与毛细管之间以及不同毛细管模式之间耦联，从而实现对复杂样品的分离。对于一些组分复杂的样品而言，仅采用一维色谱分离模式无法使所有组分达到满意的分离。因此，多维色谱的出现很好地解决了复杂样品的分离分析问题，大大提高了色谱的分离能力和选择性。

多维色谱-质谱(MDC-MS)联用技术原理是：将分子在多维色谱中进行分离后，通过MS对多肽进行序列分析，确定所分析的生物分子的结构和质量。二维LC-质谱联用如图9-9所示。

目前常用的是二维液相色谱与质谱的联用，二维液相色谱包括离子交换色谱-体积排阻色谱、离子交换色谱-反相液相色谱、亲和色谱-反相液相色谱、色谱聚焦-反相液相色谱等。除了上述二维液相色谱分离系统外，多维色谱-质谱分离模式还包括液相色谱与毛细管电泳组合及二维毛细管电泳分离模式与各种质谱在线联用等。

图9-9　二维LC与质谱联用检测蛋白质

借助多维色谱的峰容量大和分离能力强的优势，各种不同分离模式耦联的多维色谱-质谱在蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学、核酸和药物监测鉴定等方面得到了广泛应用。Riggs等建立了全自动的利用特征肽的鉴定进行蛋白质组学分析的多维色谱-质谱联用技术，建立亲和色谱反相-金属亲和色谱分离-反相色谱分离-TOF-MS分析等全套操作，并通过计算机软件控制实现自动化。Nishino等建立由强阴离子交换柱、强阳离子交换柱和ODS柱耦联的多维色谱在线联用的代谢组学研究体系，并用于人和其他3种动物尿液和血液中头孢类抗生素及其7个代谢物的分离监测，结果表现出其重复性好、灵敏度高等特点。Chong等已经成功地将色谱聚焦分离-反相液相色谱分离-质谱联用技术应用于人乳腺上皮细胞裂解液中蛋白质的分离，进行了在线分析。