的基本原理和类型

酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原抗体反应的高度特异性与酶对底物催化作用的高效性相结合，检测液体标本中微量物质的一种方法，自20世纪70年代初问世以来，已成为临床实验室应用做广泛的免疫学技术之一。ELISA具有特异性强、灵敏度高、标记酶稳定性好、试剂保存时间长、避免了放射性核素对人体的危害及环境的污染、无需昂贵仪器设备、检测成本低的特点，加之目前常规检测试剂的商品化和各种自动化酶联检测仪的出现，因而使操作程序更加规范、简便、快捷。

ELISA既可用于检测抗原也可用于检测抗体。在这种测定方法中有3个总共要组成部分：固相抗原（或）抗体，称为“免疫吸附剂”（immunsosrbent）、酶标记抗原或抗体（conjugate）、酶促反应的底物。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型。

1．双抗体夹心法检测抗原　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，其基本原理是将特异性抗体包被于固相载体的微孔中，形成固相抗体；加入待检标本，标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；加入酶标抗体，固相免疫复合物中的抗原与酶标抗体结合，此时固相载体上结合的酶量与标本中待检抗原的量呈正相关；加入底物后固相上的酶催化底物成为有色产物，显色越深标本中的抗原含量越高。该方法适用于检测各种蛋白质等二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及单个抗原决定簇的小分子物质。

此法只要获得针对待检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。若抗体来源为抗血清，包被抗体和酶标记所用抗体最好分别取自不同属性的动物。如采用单克隆抗体，一般选择抗原上两个不同决定簇的单克隆抗体，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，可以将待测抗原、酶标抗体同时加入，做一步法检测。

2．间接法检测抗体　间接法是检测抗体的常用方法，利用酶标记的第二抗体检测与固相抗原结合的待检抗体，故称为间接法。将特异性抗原包被于固相载体形成固相抗原，加入待检标本，其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物；加入酶标记第二抗体，一般多采用酶标记抗人IgG检测IgG抗体；固相免疫复合物的待测抗体与酶标记第二抗体结合，从而间接地标记上酶，酶量与待检抗体的含量呈正相关。

间接法ELISA严格来讲仅适用于检测总抗体或IgG类抗体，这主要是由酶标记第二抗体所决定的，目前多用于对病原体抗体的检测，如抗HCV及抗HIV和梅毒螺旋体抗体等测定；优点是只要改变包被抗原就可利用同一种酶标记第二抗体建立检测相应抗体的方法。

3．双抗原夹心法检测抗体　双抗原夹心法反应模式与双抗体夹心法相似，即用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。该方法关键在于酶标记抗原的制备，应根据抗原结构不同，采用适当的标记方法。

与间接法检测抗体不同之处：此法中以酶标记抗原代替酶标记第二抗体，待检标本不需稀释，可直接用于测定；也可采用一步法检测，由于机体产生IgG抗体的滴度有限，因而不会出现钩状效应；实际上间接法只是测定的IgG类抗体，而该法则可检测各类抗体，且不受非特异性IgG类抗体的干扰，因此其敏感度和特异性相对高于间接法。

4．竞争法检测抗原　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的2个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法。原理是标本中的抗原和一定量的酶标记抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色反应愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

5．竞争法检测抗体　标本中的抗体和一定量的酶标记抗体竞争与固相杭原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标记抗体越少，显色反应越浅。竞争法检测抗体常用的模式有两种，一种是包被抗原，形成固相抗原，同时加入标本和酶标记抗体与固相抗原竞争结合；另一种是将标本与中和抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。

抗体的测定一般不采用竞争法，当抗原中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原，抑或是抗原的结合特性不稳定时，可采用此法。竞争法检测抗体不同于测只有单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法，其可靠性很大程度上取决于竞争抗体的特异性和亲和力大小，但竞争抗体目前均为免疫动物所得，这与病毒感染机体产生的抗体会有所差异，因此，在临床上检测HBe－AB和HBcAB时，常出现难以解释的结果，其与方法学上的缺陷有很大关系。

6．捕获包被法检测抗体　测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgMμ链抗体包被，以捕获血清标本中的IgM类抗体；加入待测标本，固相抗人IgMμ抗体即与标本中待测IgM（特异性和非特异性）结合，再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记的针对抗原的特异性抗体；最后与底物作用，呈色反应即与标本中的IgM呈正相关。

IgM抗体也可采用抗原包被的间接法测定，但由于标本中常同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，因此，如用抗人IgM作为第二抗体间接法测定IgM抗体，必须先将标本中SPA或抗人IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。