检查样品处理

流式细胞仪测定的是单个细胞或单个微粒。因此，检测样品均为单细胞悬液。单细胞悬液可以来自于培养的细胞、血液、新鲜实体组织及石蜡包埋组织等，不同组织细胞的分离方法不同。

【样品制备】　由于流式细胞仪所用的细胞可来自不同的组织或细胞，单细胞悬液的制备方法也不同，下面仅对几种常用细胞悬液的制备方法作一简单介绍。

1．新鲜实体组织单细胞悬液　目前常用的分离新鲜实体组织的方法是酶消化法和机械法。

（1）酶消化法：常用的酶包括蛋白酶、胶原酶、溶菌酶等。在使用时应注意酶的浓度、消化温度及消化时间。在消化完成时应使用300目或200目尼龙网过滤，并经低速离心。

（2）机械法：常用方法为剪刀剪碎法和研磨法，其中剪碎法步骤如下：①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；②用剪刀将组织剪至匀浆状；③加入10ml生理盐水；④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管内；⑤离心沉淀1　000r／min，4～5min，再用生理盐水洗3次，每次以短时低速（500～800r／min）离心沉淀去除细胞碎片；⑥以300目尼龙网过滤去除细胞团块；⑦选择适当的固定液（70%冰乙醇等）固定细胞或低温保存备用。上述方法对实体组织的成分会产生不同程度的影响，应根据实验目的选择合适的方法，同时新鲜组织标本应及时处理保存，避免细胞自溶导致的DNA降解，应根据实验目的选择合适的固定方式。

2．培养细胞单细胞悬液　培养细胞一般以悬浮或贴壁方式生长。对悬浮生长细胞先用吸管反复吹打的方式分散聚团的细胞，然后常规洗涤、低速离心法去碎片、沉淀细胞，再次悬浮即可获得单细胞悬液。对于贴壁生长细胞，需要将培养细胞用0．04%EDTA－2Na或0．29%胰蛋白酶消化进行消化处理，消化时在显微镜下见到贴壁细胞之间出现筛状间隙时弃去消化液，用PBS缓冲液终止消化，尔后用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中，以即800～1　000r／min离心5min，弃上清。反复漂洗2～3次，以去除细胞碎片。最后加少许PBS将沉淀细胞轻轻吹打均匀，即可获得单细胞悬液。制成的悬液可低温保存或固定细胞备用。

3．外周血单细胞悬液　血细胞成分包括红细胞、白细胞和血小板等有形成分，白细胞包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。为了满足流式细胞仪分析的需要，采集的血液应进行抗凝处理（2ml），样本管于18～25℃室温下保存，一般应在取血后6h之内使用。本文仅介绍单个核细胞制备，具体步骤如下。

（1）将抗凝处理的全血2ml用生理盐水稀释至4ml，并将其沿试管内壁缓缓加入到放有3ml淋巴细胞分离液的液面之上，保持清晰的分层状态，切勿使血液和分离液混合。

（2）室温下，离心2　000r／min，30min。离心后试管内的血液清晰地分为4层：上层为血浆，中层为分离液，上层和中层之间白色薄层为淋巴细胞层，底层为红细胞层，红细胞层上面为粒细胞层。

（3）用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另一离心管中，用生理盐水液稀释至10ml，离心洗涤2次（1　500r／min，10min）。

（4）弃上清后加入少许生理盐水或培养液即得到大量单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）。

（5）固定细胞或置4℃冰箱保存备用。

【荧光标记】

1．直接免疫荧光标记法　取一定量细胞（约1×106细胞／ml），在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1min以上，再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入）。孵育20～60min后，用PBS（pH　7．2～7．4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。此法更适用于临床标本的检测。

2．间接免疫荧光标记法　取一定量的细胞悬液（约1×106细胞／ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

【对照设置】　与其他生物学实验一样，FCM检测也需要设置对照，以避免假阴性和假阳性结果。

1．阳性对照　阳性对照是指表达特异性抗原的细胞或能够与选定荧光染料特异结合的细胞。例如，T淋巴细胞可作为CD3检测的阳性对照。在FCM分析中，若事先不能确定待测细胞是否表达某种抗体时，需要设置阳性对照以验证实验结果的可靠性。

2．阴性对照　阴性对照是指不表达某种抗原的细胞或不能与特定荧光染料结合的细胞。包括阴性细胞群对照和同型对照（immunoglobulin　isotype　control）。阴性细胞是指没有标记任何抗体的细胞群，如NK细胞作为CD3的阴性对照，而同型对照是指与单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型。同型对照是用未免疫鼠血清制备的纯化的IgG1或IgG2，并标记了FITC或PE等。如IgG1FITC可作为所有IgG1亚型并标记FITC荧光素的特异性荧光抗体的同型对照。