四氢呋喃与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱法研究

四氢呋喃与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱法研究

鲁文红　郑　丹　龙婷婷

（华中科技大学同济医学院公共卫生学院，湖北武汉430030）

摘　要：本文采用荧光光谱法，研究了四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF）与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）相互作用的机理，探讨了温度对其反应的影响，并得到了不同温度下的结合常数，并对其猝灭机理进行了讨论。实验证明了四氢呋喃对BSA的猝灭作用是属于静态猝灭，进一步通过计算得出了不同温度下的Stern-Volmer猝灭常数K_SV。

关键词：牛血清白蛋白　四氢呋喃　荧光光谱　荧光猝灭

血清白蛋白是循环系统中用量最多的可溶性蛋白质，可以维持体内生理环境相对稳定，在血液中有运输功能，在临床上也可用作血容量扩充剂，提高血浆胶体渗透压，增加血容量等。由于血清白蛋白在生物体内的重要作用，它的测定在临床医学和生命科学研究中有重要意义。

四氢呋喃是一类杂环有机化合物，是最强的极性醚类之一，在化学反应和萃取时用做一种中等极性的溶剂。四氢呋喃具有低毒、低沸点、流动性好等特点，是一种重要的有机合成原料和优良的溶剂，具有广泛的用途，有“万能溶剂”之称。作为常用溶剂，四氢呋喃已普遍用于表面涂料、保护性涂料、油墨、萃取剂和人造革的表面处理。四氢呋喃是生产聚四亚甲基醚二醇（PTMEG）重要原料，也是制药行业的主要溶剂。

研究生物大分子与活性小分子的相互作用，对了解生物大分子的结构、功能具有重要的作用。本文用荧光光谱法研究了四氢呋喃在接近人体生理条件下（pH＝7.4）与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，对不同温度下四氢呋喃引起牛血清白蛋白荧光猝灭强度的不同进行了研究，并对其猝灭机理进行了讨论。实验证明了四氢呋喃对BSA的猝灭作用是属于静态猝灭，进一步通过计算得出了不同温度下的Stern-Volmer猝灭常数KSV。

1　实验部分

1.1　主要试剂与仪器

试剂：牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（生化试剂，Sigma公司产品）：用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液溶解，配制为1.0×10-5 mol·L-1BSA储备溶液。四氢呋喃（C₄H8O，Tetrahydrofu-ran，THF）（分析纯，天津市化学试剂三厂），甲醇（CH3O）（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），无水乙醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），氯化钠（NaCl）（分析纯，天津市化学试剂三厂），三羟甲基氨基甲烷（Tris）（国药集团化学试剂有限公司）。

缓冲液（浓度为0.05mol·L-1，内含0.15mol·L-1 NaCl）：准确称取0.606gTris，加0.877g NaCl，用三蒸水定容至100mL。在温度T＝298K下用HCl调节pH＝7.4，4℃保存备用；实验用水均为三蒸水。

仪器：CS501型超级恒温水浴锅（重庆试验设备厂制造），LS-55荧光分光光度计（PerkinElmer公司，美国制造），电子天平，pHS-3C数字酸度计（上海分析仪器），微量注射器（Eppendorf公司，德国）。

1.2　实验步骤

准确移取2.5mL 1.0×10-6 mol·L-1的BSA于1cm石英比色皿中，用微量注射器逐次加入一定量的四氢呋喃，搅拌混合均匀避光静置两分钟后，分别在25℃（298K）、29℃（302K）、33℃（306K）、37℃（310K）下以280nm为激发波长，在LS-55荧光分光光度计上扫描280～500nm波长范围内的发射光谱。激发和发射狭缝宽度均选择2.5nm，扫描速度为100nm/min，

2　实验结果与讨论

用荧光光谱法，在近似生理条件下（pH＝7.4），不同浓度的四氢呋喃与血清白蛋白相互作用，用荧光分光光度计扫描得出280～500nm波长范围内的扫描曲线。在不同温度（T＝298K、302K、306K、310K）条件下，重复实验，得到不同温度下的四氢呋喃对血清白蛋白荧光光谱的影响曲线。随着四氢呋喃加样量增大，曲线峰值呈下降趋势（图1）。

图1　四氢呋喃对血清白蛋白荧光光谱的影响

（T＝298K，λex＝280nm，c（BSA）＝1.0×10^-6 mol·L^-1，c（THF）（4.9×10^-3 mol·L^-1）B～M：0；4；8；12；16；20；30；40；50；60；80；100）

图2　不同温度下四氢呋喃猝灭BSA荧光的Stern-Volmer关系图

表1　不同温度下THF与血清白蛋白作用的Stern-Volmer猝灭常数

注：R是相关系数。

2.1　四氢呋喃对牛血清白蛋白的荧光猝灭

血清白蛋白的荧光主要来自色氨酸残基的内源荧光，为了使酪氨酸和苯丙氨酸对荧光的影响降至最低，本实验以λex＝280nm激发，在350nm附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发四氢呋喃时，在350nm附近则没有荧光峰，表明亚四氢呋喃不会产生与BSA相互干扰的荧光。固定BSA的浓度为1.0×10-6 mol·L-1，随着体系中四氢呋喃浓度的增加，BSA的内源荧光产生明显的猝灭（图1）。为了方便讨论，此次实验选择分析纯四氢呋喃的体积在0～100μL范围内（四氢呋喃每加1μL，浓度为4.9×10^-3 mol·L-1）。

荧光猝灭作用是指任何能够通过相互作用（如分子重排、激发态反应、能量转移、形成基态复合物以及碰撞猝灭等）使荧光物质荧光强度降低的现象。能与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质则称为猝灭剂。荧光猝灭过程分为动态猝灭、静态猝灭、混合猝灭等。其过程均遵循Stern-Volmer方程：

式（1）中：F₀表示不存在猝灭剂时体系中荧光物质的荧光强度；F表示存在猝灭剂时体系中荧光物质的荧光强度；KD是猝灭过程动态猝灭常数；KS是猝灭过程静态猝灭常数；［Q］是猝灭剂的浓度。

为研究和讨论方便，通常将荧光猝灭过程分为动态猝灭和静态猝灭来讨论。无论是单一动态猝灭还是单一静态猝灭，其过程均遵循典型的Stern-Volmer方程。

若猝灭过程为动态猝灭，即猝灭是由荧光猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用引起的，则式（1）可以改写为Stern-Volmer方程来描述：

式（2）中：F₀和F分别表示不存在及存在猝灭剂时体系中荧光物质的荧光强度；KSV是Stern-Volmer常数，一定程度上可以反应荧光物质与猝灭剂之间相互作用的程度和猝灭作用的性质。

若猝灭过程为静态猝灭，则猝灭剂与荧光物质分子在基态时形成较稳定的不产生荧光的复合物。复合物的形成导致荧光物质荧光强度降低，则式（1）可改写为以下方程描述：

式（3）中：F0和F分别表示不存在及存在猝灭剂时体系中荧光物质的荧光强度；KS是基态复合物的生成常数，一定程度上可以反映基态复合物的生成情况，有时被当做复合物的稳定常数。

由式（2）、式（3）可看出在适当的浓度范围，无论是动态猝灭过程还是静态猝灭过程，F₀/F与［Q］之间均存在线性关系。判断猝灭机理需要对两种不同猝灭方式区别进行。动态猝灭过程依赖于猝灭剂和激发态分子的扩散过程，温度升高时溶液的黏度下降，分子的运动加速，导致扩散系数增大，因而其猝灭常数随温度升高而增大；而静态猝灭过程依赖于基态复合物的形成，温度升高导致基态复合物的稳定性下降，因而静态猝灭的猝灭常数随温度升高而降低。

2.2　小结

实验证明不同温度下不同浓度的THF猝灭血清白蛋白的荧光强度，是随着THF加入的计量增大，即THF的浓度增大，BSA的荧光强度降低，形成荧光猝灭，同时，可以看出，同一浓度的THF，随着温度的升高，BSA的荧光强度下降。固定BSA的浓度，用微量进样器逐量加入THF溶液，以激发波长λex＝280nm扫描体系的荧光光谱（图1）。由图1可见，随着THF的不断加入，BSA在350nm附近处的荧光强度逐渐减弱，且最大发射波长明显蓝移。血清白蛋白在350nm附近的发射峰可归属于其色氨酸残基的发光，而色氨酸残基的最大发射波长与其所处的微环境有关，发射峰波长蓝移，这表明THF使得血清白蛋白的构象发生了变化，从而使色氨酸残基周围的疏水性有所增加，也就是说THF使得BSA更多地暴露于疏水环境中。

从图2可以看出，曲线有良好的线性关系，且随着温度升高BSA的猝灭曲线的斜率降低，即猝灭常数将随温度的升高而减小，因此可初步判断该过程不是动态猝灭过程，而是静态猝灭过程。表1为不同温度下THF对BSA荧光猝灭的猝灭常数。从表1可以看出，Kq数量级在10¹²，远远大于最大扩散碰撞猝灭常数2.0×10¹⁰L·mol^-1·s^-1，因而可以进一步证明以上猝灭过程为静态猝灭过程。

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