实验32 免疫荧光技术
(Immunofluorescence techniques)
【目的】
了解免疫荧光技术的基本原理、常用方法及其实际应用。
【原理】
免疫荧光技术是根据抗原-抗体反应具有高度特异性，以荧光色素(常用异硫氰酸荧光素，FITC)作为标记物与已知的抗体或(抗原)作为标准试剂，用于鉴定未知的抗原(或抗体)。在荧光显微镜下可以直接观察呈现特异性荧光的抗原-抗体复合物及其存在部位或通过流式细胞仪分析。因此，免疫荧光技术是将免疫反应的特异性与灵敏度和显微示踪技术的精确性相结合，是现代医学和生物学研究中广泛应用的免疫标记检测方法之一。
用荧光抗体检测抗原的方法较为常用。一般称为荧光抗体技术。根据抗原-抗体反应的不同，荧光抗体技术有直接法、间接法和补体法三种。下面主要介绍常用的直接法和间接法。
一、直接法
检测B细胞表面膜免疫球蛋白(SmIg)。人类B细胞表面带有SmIg，它能与特异性抗Ig抗体结合。故可用荧光色素标记的抗Ig抗体作直接免疫荧光染色镜检。
【材料】
1.肝素抗凝的新鲜外周血液标本。肝素浓度10～12.5U/ml。
2.淋巴细胞分层液(Ficoll)，比重1.077±0.01。
3.破红细胞液Tris-NH4Cl。
4.异硫氰酸荧光素标记的兔抗人Ig抗体。
5.含5％新生小牛血清的Hanks液。
6.荧光显微镜、细胞计数器等。
【方法】
1.淋巴细胞悬液的制备(见实验24淋巴细胞分离技术):用含5％新生小牛血清的Hanks液制成每毫升内含1×107/ml淋巴细胞的悬液。活的淋巴细胞应高于95％。
2.向小试管内(10mm×75mm)加入淋巴细胞悬液100μl及1∶8～1∶6稀释的荧光色素(FITC)标记兔抗人Ig抗体100μl，轻轻摇动混合。
3.管口加塞。将试管放入冰箱内作用45～60min。
4.于管内加入2ml的含小牛血清的Hanks液。轻摇混合。离心沉淀(1500r/min×5min)。
5.倾弃上清液。再加入2ml的含小牛血清的Hanks液，将细胞重复洗涤、离心、沉淀一次。
6.倾弃上清液。并将试管倒置于吸水纸上片刻，吸去管残余的液体。用毛细吸管吸取管底沉淀细胞滴加于载玻片上。置荧光显微镜下观察。
7.在荧光显微镜下，先用普通光源计数视野中的淋巴细胞总数。每份标本至少计数200个淋巴细胞，然后用荧光光源计数阳性细胞百分率。
【结果】
B细胞常在细胞膜上呈明亮的黄绿色斑点状或半月形(帽状)荧光，有时亦可见到整个细胞膜四周呈现环状荧光。细胞悬液中混杂的多型核白细胞有时亦呈现片状或均匀的荧光染色。
【注意事项】
1.应在普通光源下加以区分。
2.外周血中SmIg阳性细胞(B细胞)的正常值为12％～24％。
二、间接免疫荧光法:检测抗核抗体
【原理】
抗核抗体又称抗核因子，是针对自身组织细胞核DNA、核蛋白等成分产生的抗体。但
此种抗体无种属和器官特异性。因此，可以用动物(大、小白鼠)的肝组织切片或有核细胞(如正常人多核白细胞、鸡红细胞)作为抗原，采用间接免疫荧光法测定待测血清中的抗核抗体。
【材料】
1.异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗人Ig抗体，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS作1∶20稀释。
2.正常人多核白细胞制片。取正常人静脉血液肝素抗凝，盛于洁净小试管内。以2000r/min离心20min，用毛细吸管吸取血细胞表层细胞层，滴于载玻片上，涂成薄层，待自然干燥后，滴加甲醇固定5min，放冰箱内备用。
3.待检血清:用PBS1∶10稀释，再经56℃加温30min灭活。
4.磷酸盐缓冲盐水(PBS0.01mol/L，pH7.4)
NaH2PO42H2 O0.59
Na2HPO412H2 O5.81
NaCl 17.00
加蒸馏水溶解至2000ml
5.缓冲甘油(封片液):pH8.6等渗巴比妥缓冲液(巴比妥10.3g，氯化钠6.2g。1mol/LHCl调至pH8.6，加蒸馏水至1000ml)1份加甘油9份。
6.荧光显微镜、盖玻片、毛细吸管、玻片染色缸等。
【方法】
1.取1∶10稀释的待检血清滴加于正常人多核白细胞制片(或大白鼠肝组织切片)上。
2.将标本平放于湿盒内，加盖，放37℃温箱内作用30min。
3.倾去待检血清，将标本放入盛满PBS的玻片染缸内，并依次在三个玻璃缸内分别浸洗3min。
4.取出标本片，用滤纸条吸干标本四周残余的水分。
5.在标本上滴加1∶20稀释的异硫氰酸荧光素标记的兔抗人Ig抗体。
6.将标本平放于湿盒内，加盖，放37℃温箱内作用30min。
7.倾去荧光抗体，同上述步骤3将标本片充分浸洗。
8.用滤纸条仔细吸干标本残余的水分后，加一滴缓冲甘油，立即覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察，必要时可再将待检血清做连续倍比稀释以测定抗核抗体的滴度。
【结果】
先置低倍镜观察，阳性者，可见有大小一致，边界清楚的绿色荧光。可疑者再以高倍镜进一步观察。
【注意事项】
1.温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。
2.注意与非特异性荧光鉴别，后者往往较大，形态不一，边界不清。
3.每次试验还应设PBS对照(鼠肝印片＋ PBS)，以排除非特异性荧光。
【思考题】
1.简述免疫荧光技术的使用范围。
2.免疫荧光技术的原理是什么?
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
