-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定牛血清白蛋白

一、目的要求

1．学习用SDS-PAGE分离鉴定蛋白质的原理。

2．掌握垂直板电泳的操作方法。

3．运用SDS-PAGE分离蛋白质及进行蛋白质染色定性分析。

二、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸铵或核黄素）和加速剂（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶具有力学性能好、化学性能稳定、灵敏度好和分辨率高等优点。因而，PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、多肽和核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。

PAGE根据其有无浓缩效应分为连续电泳体系和不连续电泳体系。

SDS 是十二烷基硫酸钠的简称，是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的半胱氨酸残基间的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS 复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 复合物基本上是相同的（约 18 μm），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。因而，SDS-PAGE 不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。

三、仪器与试剂

1．试剂

（1）凝胶储备液：30%丙烯酰胺/N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（Acr/Bis）：称取29.2 g Acr及0.8 g Bis，溶于蒸馏水中，最后定容至100 m L，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。

（2）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl（p H6.8）：量取1 mol/L Tris母液50 m L，用盐酸调节p H值至6.8，用蒸馏水定容至100 m L，4℃储存。

（3）分离胶缓冲液：1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）p H8.8：量取3 mol/L Tris母液50 m L，用盐酸调节p H值至8.8，用蒸馏水定容至100 m L，4℃储存。

（4）10% SDS溶液：称取SDS 10 g，加重蒸水微热使其溶解，并定容至100 m L。在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

（5）1%四甲基乙二胺（TEMED）：取TEMED 1 m L，加重蒸水定容至100 m L，置于棕色试剂瓶，4℃储存。

（6）10%过硫酸铵（AP）：称取AP 1 g，加重蒸水定容至10 m L，现用现配。如长期使用，配制后分装至1.5 m L离心管中，-20℃储存。

（7）5×电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液p H8.3）：称取Tris 7.5 g，甘氨酸（Gly）36 g， SDS 2.5 g，用蒸馏水溶解后定容至500 m L，使用时稀释5倍使用，4℃储存。

（8）2×上样缓冲液：取0.5 mol/L Tris-HCl（p H6.8）2.0 m L，20%（W/V）SDS 2 m L，巯基乙醇1.0 m L，甘油2.0 m L，0.1%溴酚蓝0.5 m L，加蒸馏水定容至10 m L。

（9）染色液：称取考马斯亮蓝G250 0.25 g，加入454 m L 50%甲醇溶液和46 m L冰乙酸，如有不溶性颗粒，过滤即可使用。

（10）脱色液：75 m L冰乙酸，875 m L重蒸水与50 m L甲醇混匀。

（11）BSA蛋白质（牛血清白蛋白）溶液：称取纯BSA蛋白5 mg，溶于1 m L蒸馏水中，置-20℃中备用。

（12）蛋白质Marker。

2．仪器

电泳装置如图2-10-1所示。

图2-10-1 电泳装置

垂直平板电泳槽、直流稳压电泳仪、脱色摇床、精密天平、酸度计和p H试纸、移液器（1.0 m L、200 μL、20 μL和10 μL）、刀片、镊子、培养皿、烧杯、试管、滴管。

四、实验操作与步骤

1．实验步骤

（1）安装垂直板电泳槽。安装前，胶条、玻璃板、槽子都要洁净干燥，勿用手接触灌胶面的玻璃。

（2）配制分离胶。根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验按表2-10-1配制20 m L 12%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8 cm高，用1 m L微量注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，3～4 mm高，加入1 m L重蒸水进行水封。约30 min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。为了防止漏胶现象的发生，可以在电泳槽平板玻璃的底部加入少许预先加热溶解的1.5%琼脂。

表2-10-1 不同浓度的分离胶配制

（3）浓缩胶的制备。按表2-10-2配制10 m L 5%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5 cm处，轻轻将梳子插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30 min后凝胶聚合，再放置20～30 min。待凝胶凝固，小心拔去梳子，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，剥去低端封口用的琼脂凝胶，并用少许蒸馏水洗涤。将p H 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液加入到储槽中，应超过短板约0.5 cm以上，即可准备加样。

表2-10-2 浓缩胶配制

（4）样品处理及加样。各标准蛋白质及待测蛋白质都用上样缓冲液溶解，使浓度为0.5～1 mg/m L，沸水浴加热3～5 min，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1 min，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为10～15 μL（即2～10 μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品加入到加样孔，待样品加好后，即可开始电泳。

（5）电泳。将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10 m A，电压100 V。待样品进入分离胶时，将电流调至20～30 m A，电压升至300 V。当蓝色的溴酚蓝染料迁移至底部约1 cm时，停止电泳，关闭电源。

（6）剥胶。电泳结束后，拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，小心用蒸馏水清洗凝胶表面，将胶板移至染色缸中染色。

（7）染色及脱色。将染色液倒入染色缸或大号培养皿中，染色1 h 左右后，回收染色液供循环使用。将染色的胶板用蒸馏水漂洗数次，放入脱色液中，置于脱色摇床上脱色，直到蛋白质区带清晰。

（8）照相。将脱色干净的凝胶用蒸馏水洗净，放置于白色玻璃板上，用凝胶成像系统摄取图像。

（9）分析凝胶电泳图像。将凝胶电泳图像用Bio Rad凝胶成像系统进行分析。

五、实验说明

（1）记录SDS-PAGE结果，分析BSA蛋白的纯度，结合蛋白Marker，判断BSA的分子量。

（2）用Bio Rad凝胶成像系统估算BSA的含量。

（3）制胶过程中，四甲基乙二胺加入量要准确，控制好聚合时间（20～40 min）。

六、思考题

1．SDS-PAGE和PAGE在原理上有何不同？

2．思考SDS-PAGE中各试剂所起的作用。

3．总结本实验成功或者失败的经验教训以及操作要注意的要点。