总淀粉的测定

1.酶水解法(GB/T5009.9—2008)

1)原理

试样经除去脂肪及可溶性糖类后，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解为麦芽糖和低分子糊精，再用盐酸进一步水解为葡萄糖，然后按还原糖测定的方法测定其还原糖含量，并折算成淀粉含量。

2)仪器

水浴锅。

3)试剂

除特殊说规定，本法中所用试剂均为分析纯。

碘(I2)、碘化钾(KI)、高峰氏淀粉酶(酶活力≥1.6U/mg)、无水乙醇(C2H5OH)、石油醚(CnH2n+2)沸点范围为60～90℃、乙醚(C4H10O)、甲苯(C7H9)、三氯甲烷(CHCl3)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(Na OH)、硫酸铜(Cu SO4·5H2O)、亚甲基蓝(C16H18Cl N3S·3H2O)、酒石酸钾钠(C4H4O5KNa·4H2O)、亚铁氰化钾((K4Fe(CN)6·4H2O)、甲基红(C15H15N3O2)、葡萄糖(C6H12O6)

①甲基红指示剂(2g/L): 称取甲基红0.02g，用少量乙醇溶解后，并定容至100m L。

②盐酸溶液(1+1): 量取50m L盐酸与50m L水混合。

③氢氧化钠溶液(200g/L): 称取20g氢氧化钠，加水溶解并定容至100m L。

④碱性酒石酸铜甲液: 称取15 g硫酸铜及0.050 g亚甲基蓝，用去离子水定容至1000m L。

⑤碱性酒石酸铜乙液: 称取50g酒石酸钾钠、75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水定容至1000m L，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

⑥葡萄糖标准溶液: 称取1g(精确至0.0001g)经过98～100℃干燥2h的葡萄糖，加水溶解后加入5m L盐酸，并以水定容至1000m L。此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。

⑦淀粉酶溶液(5g/L): 称取高峰氏淀粉酶0.5g，加100m L水溶解，临用现配; 也可加入数滴甲苯或三氯甲烷防止长霉，贮于4℃冰箱中。

⑧碘溶液: 称取3.6 g碘化钾溶于20 m L水中，加入1.3 g碘，溶解后加水定容至100m L。

⑨85%乙醇: 取85m L无水乙醇，加水定容至100m L。

4)分析步骤

(1)样品处理

①易于粉碎的试样: 磨碎过40目筛，称取2～5g(精确至0.001g)，置于放有折叠滤纸的漏斗内，先用50m L石油醚或乙醚分5次洗除脂肪，再用约150m L乙醇(85%)洗去可溶性糖类，滤干乙醇，将残留物移入250m L烧杯内，并用50m L水洗滤纸，洗液并入烧杯内，将烧杯置沸水浴上加热15min，使淀粉糊化。放冷至60℃以下，加20m L淀粉酶溶液，在55℃～60℃保温1h，并时时搅拌。然后取1滴此液加1滴碘溶液，应不显蓝色，若显蓝色，再加热糊化并加20m L淀粉酶溶液，继续保温，直至加碘不显蓝色为止。加热至沸，冷后移入250m L容量瓶中，并加水至刻度，混匀，过滤。弃去初滤液，取50m L滤液，置于250m L锥形瓶中，加5m L(1+1)盐酸，装上回流冷凝器，在沸水浴中回流1h，冷后加2滴甲基红指示剂，用氢氧化钠溶液(200g/L)中和至中性，溶液转入100m L容量瓶中，洗涤锥形瓶，洗液并入100m L容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。

②其他样品: 加适量的水在组织捣碎机捣成浆(蔬菜、水果需洗净晾干，取可食部分)，称取相当于原样质量2.5～5g(精确到0.001g)的匀浆，以下按①易于粉碎的试样中自“置于放有折叠滤纸的漏斗内”起依法操作。

(2)标定碱性酒石酸铜溶液

吸取5.0m L碱性酒石酸铜甲液及5.0m L碱性酒石酸铜乙液，置于150m L锥形瓶中，加水10m L，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加约9m L葡萄糖标准溶液。控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖，直至溶液蓝色刚好褪去，即为滴定终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时做三份平行，取其平均值，计算每10m L(甲液、乙液各5m L)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)。

注: 也可以按上述方法标定5～20m L碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)来适应试样中还原糖的浓度变化。

(3)试样溶液预测

吸取5.0m L碱性酒石酸铜甲液及5.0m L碱性酒石酸铜乙液，置于150m L锥形瓶中，加水10m L，加入玻璃珠两粒，控制在2min内加热至沸腾。保持沸腾以先快后慢的速度，从滴管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直到溶液蓝色刚好褪去为，即为滴定终点，记录样液消耗体积。当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，在10m L左右，结果按式(8-15)计算。

(4)试样溶液测定

吸取5.0m L碱性酒石酸铜甲液及5.0m L碱性酒石酸铜乙液，置于150m L锥形瓶中，加水10m L，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加比预测体积少1m L的试样溶液至锥形瓶中，使在2min内加热至沸腾，保持沸腾继续以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖，直至溶液蓝色刚好褪去，即为滴定为终点。记录样液消耗的体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积。

同时量取50m L水及与试样处理时间相同量得淀粉酶溶液，按同一方法做试剂空白试验。

5)计算结果

试样中还原糖的含量(以葡萄糖计)按式(8-17)进行计算。

式中: X——试样中还原糖的含量(以葡萄糖计)，单位为克每百克(g/100g);

A——碱性酒石酸铜溶液(甲液、乙液各半)相当于葡萄糖的质量，单位为毫克(mg);

m——试样质量，单位为克(g);

V——测定时平均消耗试样溶液体积，单位为毫升(mg)。

试样中淀粉的含量按式(8-18)进行计算。

式中: X——试样中淀粉的含量，单位为克每百克(g/100g);

A1——测定用试样中葡萄糖的质量，单位为毫克(mg);

A2——试剂空白中葡萄糖的质量，单位为毫克(mg);

0.9——以葡萄糖计换算成淀粉的换算系数;

m——称取试样质量，单位为克(g);

V——测定用试样处理液的体积，单位为毫升(m L)。

计算结果保留到小数点后一位。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

6)说明与注意事项

①淀粉酶水解样品具有专一性和选择性，它只水解淀粉而不会水解半纤维素、多缩戊糖、果胶质等多糖，所以该法不受这些多糖的干扰，水解后可直接过滤除去这类多糖。适合富含纤维素和多缩戊糖等多糖含量高的样品，分析结果准确可靠，重现性好。但是酶催化活力的稳定性受p H和温度的影响很大，而且操作烦琐、费时，使用受到了一定程度的限制。

②淀粉粒具有晶格结构，淀粉酶难以作用。加热糊化破坏了淀粉的晶格结构，使其易于被淀粉酶作用。脂肪的存在会妨碍酶对淀粉的作用及可溶性糖类的去除，故应用乙醚脱脂，若样品中脂肪含量较少，可省略此步骤。

③常用于液化的淀粉酶是麦芽糖酶，它是α-淀粉酶和β-淀粉酶的混合物。α-淀粉酶水解直链淀粉的初始产物是低分子糊精，最终产物是麦芽糖和葡萄糖; 对支链淀粉初始产物是界限糊精和低分子糊精，最终产物是麦芽糖、异麦芽糖和葡萄糖。β-淀粉酶对直链淀粉和支链淀粉的水解产物都是麦芽糖。所以采用麦芽糖酶时，水解产物主要是麦芽糖，还有少量的葡萄糖。

④使用淀粉酶前，应确定其活力及水解时加入量。可用已知浓度的淀粉溶液少许，加入一定量淀粉酶溶液，至55～60℃水浴中保温1h，用碘液检验淀粉是否水解完全，以确定酶的活力及水解时的用量。一般淀粉酶的活力为1 25，1 50，1 100。

⑤对富含半纤维素、多缩戊糖及果胶质的样品，因水解时它们也被水解为木糖、阿拉伯糖等还原糖，测定结果会偏高。

2.酸水解法(GB/T5009.9—2008)

1)原理

样品经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用酸水解成具有还原性的单糖，然后按还原糖测定，折算成淀粉。

2)仪器

水浴锅、高速组织捣碎机、回流装置，并附250m L锥形瓶。

3)试剂

除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。

①甲基红指示液(2g/L): 称取甲基红0.20g，用少量乙醇溶解后，并定容至100m L。

②氢氧化钠溶液(400g/L): 称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100m L。

③乙酸铅溶液(200g/L): 称取20g乙酸铅，加水溶解并稀释至100m L。

④硫酸钠溶液(100g/L): 称取10g硫酸钠，加水溶解并稀释至100m L。

⑤盐酸溶液(1+1): 量取50m L盐酸，与50m L水混合。

⑥85%乙醇: 量取85m L无水乙醇，加水定容至100m L。

⑦精密p H试纸: 6.8～7.2。

4)操作方法

(1)样品处理

①易于粉碎的试样: 将试样磨碎过40目筛，称取2～5g(精确至0.001g)，置于放有慢速滤纸的漏斗中，用50m L石油醚分5次洗去样品中脂肪，弃去乙醚。再用150m L乙醇(85 %)溶液分数次洗涤残渣，除去可溶性糖类物质。并滤干乙醇溶液，以100m L水洗涤漏斗中残渣并转移至250m L锥形瓶中，加入30m L盐酸(1+1)，接好冷凝管，置沸水浴中回流2h。回流完毕后，立即置流水中冷却。待样品水解冷却后，加入2滴甲基红指示剂，先以氢氧化钠溶液(400g/L)调至黄色，再以盐酸(1+1)校正至水解液刚变红色为宜。若水解液颜色较深，可用精密p H试纸测试，使样品水解液的p H值约为7。然后加20 m L乙酸铅溶液(200g/L)，摇匀，放置10min。再加20m L硫酸钠溶液(100g/L)，以除去过量的铅。摇匀后将全部溶液及残渣转入500m L容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中，加水稀释至刻度。过滤，弃去初滤液20m L，滤液供测定用。

②其他样品: 加适量水在组织捣碎机中捣成匀浆(蔬菜、水果需先洗净、凉干，取可食部分)。称取相当于原样质量2.5～5g的匀浆(精确至0.001g)于250m L锥形瓶中，用50m L石油醚或乙醚分五次洗去试样中脂肪，弃去石油醚或乙醚。以下按①易于粉碎的试样中自“再用150m L乙醇(85%)溶液”起依法操作。

(2)测定

按还原糖的测定步骤操作。

5)结果计算

式中: X——试样中淀粉的含量，单位为克每百克(g/100g);

A1——测定用试样中水解液还原糖质量，单位为毫克(mg);

A2——试剂空白中还原糖质量，质量单位为毫克(mg);

0.9——还原糖(以葡萄糖计)换算成淀粉的换算系数;

m——试样质量，单位为克(g);

V——测定用试样水解液体积，单位为毫升(m L);

500——样品液总体积，m L。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

6)说明与注意事项

①此法一步可将淀粉水解至葡萄糖，简便易行，适用于淀粉含量较高，而半纤维素和多缩戊糖等其他多糖含量较少的样品。对富含半纤维素、多缩戊糖及果胶质的样品，因水解时他们也被水解为木糖、阿拉伯糖等还原糖，使测定结果偏高。为了比较准确地测定食物中淀粉含量，可先采用淀粉酶糖化淀粉，除去不可溶性的残渣后，再用酸水解使之成为葡萄糖，然后测定其含量，最后换算成淀粉。

②样品含可溶性糖时，会使结果偏高，可用85%(体积分数)的乙醇分数次洗涤样品以除去。脂肪会妨碍乙醇溶液对可溶性糖的提取，所以要用乙醚分数次洗去样品中的脂肪。脂肪含量较低时，可省去乙醚脱脂肪步骤。

③水解条件要严格控制，要保证淀粉水解完全，避免因加热时间过长对葡萄糖产生影响(形成糠醛聚合体，失去还原性)。对于水解时取样量、所用酸的浓度及加入量、水解时间等条件，各方法规定有所不同。在国家标准分析方法中，样品中加入了30m L6mol/L盐酸，使混合液中盐酸的浓度大5%，要求100℃水解2h。其他方法还有: 混合液中盐酸的浓度达1%时，100℃水解4h; 混合液中盐酸浓度达2%时，100℃水解2.5h。

④因水解时间较长，应采用回流装置，以保证水解过程中盐酸的浓度不发生变化。

3.旋光法

1)原理

淀粉具有旋光性，在一定的条件下旋光度的大小与淀粉的浓度成正比。用氯化钙溶液提取淀粉，使之与其他成分分离，用氯化锡沉淀提取液中的蛋白质后，测定旋光度，即可计算出淀粉的含量。计算公式见式(8-20)。

式中: α——旋光度读数(°);

L——观测管长度，dm;

m——样品的质量，g;

203——淀粉的比旋光度。

2)说明与注意事项

①本法适用于不同来源的淀粉，具有重现性好、操作简单、快速等特点。由于淀粉的比旋光度大，直链淀粉和支链淀粉的比旋光度又很接近，因此本法对于可溶性糖类含量不高的谷物样品具有较高的准确度。但对于一些未知或性质不清楚的样品及淀粉已经受热或变性，分析结果的误差较大。

②本法属于选择性提取法。用氯化钙溶液作为淀粉的提取剂，是因为钙能与淀粉分子上的羟基形成络合物，使淀粉与水有较高的亲和力而易溶于水。

③蛋白质也具有旋光性，为消除其干扰，本法加入氯化锡溶液，以沉淀蛋白质，蛋白质含量较高的样品，如高蛋白营养米粉，用旋光法测定时结果偏低，误差较大。

④淀粉的比旋光度一般按203°计，但不同来源的淀粉也略有不同，如玉米，小麦淀粉为203°，豆类淀粉为200°。

4.酶-比色法

淀粉在淀粉葡萄糖苷酶(AGS)催化下，最终水解为葡萄糖。葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧的条件下，催化β-D-葡萄糖(葡萄糖水溶液)氧化，生成D-葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢。受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺。

生成的醌亚胺在505nm波长下有最大吸收峰，可通过测定吸光度值计算食品中淀粉的含量。计算公式见式(8-21)。

式中: ω——样品中淀粉的含量，%;

m1——标准曲线上查出的试液中淀粉含量，μg;

m2——试样的质量，g;

V1——试液的定容体积，m L;

V2——测定时吸取试液的体积，m L。

本法简单快速，选择性好，不受其他糖类物质的干扰，适用于各类样品中淀粉的测定，最低检出限量为0.09μg/m L。但需专用试剂，价格昂贵，不易保存，应用受到限制。