考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量

一、目的要求

1．掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理。

2．学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基与考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下可以结合的原理，使染料的最大吸收峰位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色，这样通过分光光度法可以定量测定微量蛋白的浓度。这种蛋白质测定法快速、灵敏，是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。

三、仪器与试剂

1．仪器

10 m L试管6个；试管架1个；0.5 m L、1 m L、5 m L移液管分别2个；恒温水浴箱、分光光度计（图2-2-1）。

2．材料与试剂

（1）待测蛋白质溶液：白菜匀浆液。

（2）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 m L 95%乙醇中，加入100 m L 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1 000 m L。

（3）标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度用0.15 mol/L Na Cl配制成1 mg/m L蛋白溶液。

图2-2-1 分光光度计

四、实验操作与步骤

（1）白菜匀浆液的制备：称取5 g白菜叶用水洗净，吸干表面水分，剪碎，加入25 m L 0.15 mol/L Na Cl置于研钵中，0℃～4℃下冰浴研磨15～20 min，8 000 r/min冷冻离心10 min，上清即为白菜叶的可溶性蛋白溶液。

（2）制备标准曲线：按照表2-2-1的条件进行混合摇匀后，在25℃下保温10 min，静置5 min，以第一管为空白，在波长595 nm下测定其吸光度值，以标准蛋白的浓度对应吸光度值做线性回归方程。

表2-2-1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制

（3）样品中蛋白质的测定：样品适当稀释后，另取一干净试管，加入稀释样品1.0 m L及考马斯亮蓝试剂5.0 m L，混匀，在25℃下保温10 min后，静置5 min，于波长595 nm下测定其吸光度值，代入标准曲线中，计算出蛋白质的含量。

五、实验说明

（1）合理稀释待测蛋白溶液，使测定值在标准曲线的线性范围内。

（2）控制好平行之间的标准误差。

（3）正确使用分光光度计。

六、思考题

1．考马斯亮蓝法测定蛋白质的优缺点有哪些？

2．哪些因素会影响测定的结果？