法测定的含量

实验十　地衣酚(苔黑酚)法测定RNA的含量

【实验目的】

1．了解和掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理。

2．熟练掌握地衣酚法测定RNA含量的方法。

【实验原理】

RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是:当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯(地衣酚)反应，在Fe³⁺或Cu²⁺催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20～250μg/ml范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此，测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。

【实验器材】

分析天平、沸水浴锅、试管、吸管、比色杯、分光光度计。

【实验试剂】

1．RNA标准溶液(须经定磷确定其纯度):取酵母RNA配成100μg/ml的溶液。

2．样品待测液:配成每毫升溶液含RNA干燥制品50～100μg。

3．地衣酚试剂:先配0．1%三氯化铁的浓盐酸(分析纯)溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成0．1%地衣酚溶液。

【实验步骤】

1．标准曲线的制作:

(1)取12支干净烘干的试管，按表6-4编号及加入试剂。平行作两份。

(2)将试管置沸水浴加热25分钟，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。

(3)分别取两平行管的平均值，以RNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，绘制标准曲线。

表6-4　　　　　　　标准曲线的制备

2．样品的测定:

取两支试管，各加入2 ml样品液，再加2 ml地衣酚-Cu²⁺试剂。如前述进行测定。

3．RNA含量的计算:

根据测得的样品光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量:

【注意事项】

1．样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。

2．本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl₂·2H₂O可减少DNA的干扰，甚至某些己糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2分钟后，DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15分钟后，在670nm下呈现最大光吸收。

【思考题】

利用本法测定RNA的含量，灵敏度较高，但特异性较差，有哪些干扰因素?如何排除干扰?