二苯胺法测定的含量

实验九　二苯胺法测定DNA的含量

【实验目的】

1．学习和掌握二苯胺法定量测定DNA含量的原理。

2．熟练掌握二苯胺法定量测定DNA含量的方法。

【实验原理】

脱氧核糖核酸(DNA)中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA浓度在40～400μg/mL范围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。

DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。可用比色法测定。其反应原理如下。

【实验器材】

分析天平、恒温水浴锅、试管、吸管、比色杯、分光光度计。

【药品试剂】

1．DNA标准溶液(须经定磷确定其纯度):取小牛胸腺DNA钠盐以5 mmol/L氢氧化钠溶液配成200μg/ml的溶液。

2．样品待测液:准确称取DNA干燥制品以5 mmol/L氢氧化钠溶液配成50～200μg/ml的溶液。在测定RNA制品中的DNA含量时，要求RNA制品的每毫升待测液中至少含有20μg DNA，才能进行测定。

3．二苯胺试剂:临用时将A液20 ml与B液0．1 ml混合即得二苯胺试剂。

A液:称取1 g重结晶二苯胺，溶于100 ml分析纯的冰乙酸中，再加入10 ml过氯酸(60%以上)，混匀储于棕色瓶中待用。

B液:配制1．6%的乙醛液，临用前配制。

【实验方法】

1．标准曲线测定:取干燥试管7支，按表6-3操作。

2．样品溶液测定:取2支试管按表6-3的7、8两管操作。

表6-3　　　　　　　标准曲线的准备以及样品的测定

3．DNA标准曲线绘制:根据测定数据，以DNA含量(μg)为横坐标，OD₅₉₅值为纵坐标，绘制出标准曲线。

4．DNA含量的计算:根据样品液测定的吸光度(OD值或A值)，在绘制DNA标准曲线上获得对应的DNA含量，然后按下式计算样品中DNA的百分含量。

【思考题】

1．利用二苯胺法测定DNA含量时，若DNA样品中混有RNA或蛋白质、糖类时，是否会有干扰?

2．简述二苯胺法测定DNA含量的原理。

3．二苯胺法测定DNA含量实验中有哪些注意事项?