定磷法测定核酸的含量

实验八　定磷法测定核酸的含量

【实验目的】

1．了解定磷法测定核酸含量的原理。

2．掌握定磷法测定核酸含量的方法。

【实验原理】

在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝。

钼蓝最大的光吸收在650～660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1～10μg无机磷。

测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量。

【实验器材】

分析天平、50 ml和100 ml容量瓶、台式离心机、离心管、25 ml凯氏烧瓶、恒温水浴锅、200℃烘箱、硬质玻璃试管、吸量管、分光光度计。

【药品试剂】

1．标准磷溶液:将分析纯磷酸二氢钾(KH₂PO₄)预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195 g(含磷50 mg)，用水溶解，定容至50 ml(含磷量为1 mg/mL)，作为储存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10μg/ml。

2．定磷试剂:按照3mol/L硫酸∶水∶2．5%钼酸铵∶10%抗坏血酸= 1∶2∶1∶1(体积比)比例和顺序配制。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。

3．沉淀剂:称取1 g钼酸铵溶于14 ml 70%过氯酸中，加386 ml水。

4．5 mol/L硫酸。

5．30%过氧化氢。

【实验方法】

1．标准曲线的绘制:

(1)取12支洗净烘干的硬质玻璃试管，按表6-2加入标准磷溶液、水及定磷试剂，平行做2份。

表6-2　　　　　　　标准曲线的制备

(2)将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温25分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定光密度。

(3)取两管平均值，以标准磷含量(μg)为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。

2．测总磷量:

(1)取4个微量凯氏烧瓶，1、2号瓶内各加0．5 ml蒸馏水作为空白对照，3、4号各加0．5 ml制备的RNA溶液(约3 mg RNA)，然后各加1～1．5 ml的5 mol/L硫酸。

(2)将凯氏烧瓶置烘箱内，于140～160℃消化2～4小时。待溶液呈黄褐色后，取出稍冷，加入1～2滴30%过氧化氢(勿滴于瓶壁)，继续消化，直至溶液透明为止。

(3)取出，冷却后加0．5 ml蒸馏水，于沸水浴中加热10分钟，以分解消化过程中形成的焦磷酸。

(4)将凯氏烧瓶中的内容物用蒸馏水定量地转移到50 ml容量瓶内，定容至刻度。

(5)取4支硬质玻璃试管，分成两组，分别加入1 ml上述消化后定容的样品和空白溶液，如前法进行定磷比色测定。测得的样品光密度减去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的μg数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的总磷量。

3．测无机磷量:

(1)取4支离心管，于2支中各加水0．5 ml，另2支中各加0．5 ml制备的RNA溶液。

(2)然后于4支离心管中各加0．5 ml沉淀剂，摇匀，以3500 r/min离心15分钟。

(3)取0．1 ml上清液，加2．9 ml水和3 ml定磷试剂，同上法比色测定。

(4)由标准曲线查出无机磷的μg数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的无机磷量。

4．计算DNA核酸含量:

(1)DNA的含磷量为9．9%，因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1μg DNA磷相当于10．1μg DNA。

(2)将测得的总磷量减去无机磷量即DNA磷量。如样品中含有RNA时，DNA磷量需减去RNA磷量，才得到DNA磷量。RNA的含磷量平均为9．5%。

(3)按如下公式计算样品中RNA量和含量。

DNA量=(总磷量－无机磷量－RNA量×9．5%)×10．1

5．计算RNA核酸含量:

(1)RNA的含磷量为9．5%，因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1μg RNA磷相当于10．5μg RNA。

(2)将测得的总磷量减去无机磷量即RNA磷量。如样品中含有DNA时，RNA磷量需减去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均为9．9%。

(3)按如下公式计算样品中RNA量和含量。

RNA量=(总磷量－无机磷量－DNA量×9．9%)×10．5

【思考题】

1．定磷法的操作中有哪些关键环节?

2．为什么所用水的质量、消化时间、钼酸铵的质量和显色时酸的浓度对测定结果影响很大?