紫外吸收法测定核酸的含量

实验七　紫外吸收法测定核酸的含量

【实验目的】

1．学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。

2．熟悉紫外分光光度计的基本原理与使用。

【实验原理】

DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用E(P)来表示，E(P)为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值(即光密度或称光吸收)。RNA的E(P)_260nm(pH7．0)为7700～7800。RNA的含磷量约为9．5%，因此每毫升溶液含1μg RNA的光密度值相当于0．022～0．024。小牛胸腺DNA钠盐的E(P)260 nm(pH7．0)为6600，含磷量为9．2%，因此每毫升溶液含1μg DNA钠盐的光密度值为0．020。故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降，会引起测定误差较大，因此采用紫外分光光度法测定核酸含量时应先设法除去杂质。

利用紫外分光光度法还可以定性地鉴定核酸的纯度。测出样品的A_260nm与A_280nm波长的光吸收值，从A_260nm/A_280nm的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A_260nm/A_280nm的比值应大于1．8，纯RNA的A_260nm/A_280nm的比值应达到2．0。

【实验器材】

容量瓶(50ml)、离心管、离心机、比色杯、紫外分光光度计。

【药品试剂】

1．0．25%钼酸铵－2．5%过氯酸沉淀剂:取3．6 ml70%过氯酸和0．25 g钼酸铵溶于96．4 ml蒸馏水中。

2．RNA或DNA样品干粉。

【实验步骤】

1．将样品配制成每毫升含5～50μg核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸收值，计算核酸浓度、含量以及两者吸收比值。

式中:

OD₂₆₀——260nm波长处光密度读数;

L——比色杯的厚度;

0．024——每ml溶液内含1μgRNA的光密度;

0．020——每ml溶液内含1μgDNA钠盐时的光密度。

2．如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处吸收值作为对照。具体操作如下。

(1)取两支小离心管，甲管加入0．5 ml样品和0．5 ml蒸馏水;乙管加入0．5 ml样品和0．5 ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀。

(2)在冰浴中放置30分钟，以3000 r/min离心10分钟，从甲、乙两管分别吸取0．4 ml上清液到两个50 ml容量瓶内，定容到刻度。于紫外分光光度计上测定260nm处吸收值。

(3)按照如下公式计算样品中核酸浓度和含量。

式中:

ΔOD₂₆₀——甲管稀释液在260nm波长处的吸收值减去乙管稀释液在260nm波长处的吸收值。

【注意事项】

1．待测样品为固体时，需用5%～6%氨水调至pH7．0助溶，氨水助溶时要随加随混匀，避免局部过碱引起核酸降解。

2．如果待测的核酸样品中含有酸溶性的核苷酸或可透析低聚多核苷酸，需加沉淀剂，若样品为纯品则可将样品配成一定浓度在紫外光及可见光分光光度计上直接测量。

3．DNA稀释或溶解最好用无菌双蒸水。如果DNA中含有酸溶性的核苷酸类，也需要加入沉淀剂进行对比测定。RNA的稀释或溶解最好用无菌双蒸水或用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水，以防止RNA降解。

【思考题】

1．用该法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点?

2．若样品中含有蛋白质，如何排除干扰?你认为最简便的方法是什么?