蛋白质含量的分光光度法测定

Determination of Protein by Spectrophotometry

一、实验目的

(1)理解分光光度法的原理。

(2)掌握分光光度法测定蛋白质含量的原理和方法。

(3)进一步熟悉722型分光光度计的组成，工作原理、操作方法及使用时注意事项。

二、预习要点

(1)实验中各种试剂分别起什么作用?

(2)如何控制测量时溶液的p H=2．2～2．8范围?

(3)如何选择参比溶液(即空白溶液)?

(4)实验中哪些试剂需准确配制和准确加入?

三、实验基本原理

偶氮胂M是一种良好的可见光分光光度法分析用的显色剂，在p H=2．2～2．8范围内，蛋白质与偶氮胂M可生成稳定的蓝色复合物，该复合物的最大吸收波长为605nm。通过测定该复合物的吸光度即可求算出蛋白质的含量。在该实验条件下，生物体内的金属离子和阴离子如K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Cl－以及维生素、肌苷、尿素、葡萄糖等对蛋白质的测定均无影响，因此，可以将样品粉碎、提纯、过滤后直接进行分光光度计法测定。

四、仪器和试剂

仪器: 722型分光光度计，比色皿(2．0cm)，电子天平，酸度计，高速匀浆器，高速离心机，比色管(210m L)，烧杯(250m L，1，500m L)，移液管(2m L， 1m L)，吸量管(1m L)，容量瓶(100m L)，量筒(100m L)，纱布。

试剂:蛋白质标准溶液(约1g·L－1)，偶氮胂M溶液(5．0×10－4mol·L－1)， KH2PO4溶液(5．0×10－3mol·L－1)，乳化剂OP水溶液(0．05%)，Na Cl溶液(1.0%)，乳酸－乳酸钠缓冲溶液(p H=2．5)，含蛋白质的样品(如干花生)。

五、实验内容

1． 含蛋白质样品的预处理

称取25g干花生，用含KH2PO4(5．0×10－3mol·L－1)和Na Cl(1．0%)的溶液(p H=7．2)在室温下浸泡4～8小时(溶液加至刚好淹没全部花生后再过量20m L左右)。然后用匀浆器匀浆，浆液于4℃下静置过夜。用三层纱布过滤，并用30m Lp H=7．2的缓冲溶液分多次洗涤滤渣，以水稀释滤液至100m L。取适量滤液在12000r·min－1转速下离心分离约20分钟，在4℃下保存离心后所得的上层清液。

2． 样品中蛋白质含量的测定

取7支10m L比色管，将其依次编号后，按照下表中的数据加入各种溶液，最后将7支比色管均用去离子水稀释至刻度，摇匀后放置15分钟。以1号为参比溶液在605nm处测得各溶液的吸光度。以5、6、7号溶液的吸光度对标准溶液的浓度作图，得一直线，延长此直线与横坐标相交，交点的绝对值即为样品清液中蛋白质的含量。

六、实验记录与结果

(本实验参考《医学基础化学实验》(双语版)冯清主编一书中实验二十“蛋白质的分光光度法测定”)

(编者: 刘绍乾)