测定蛋白质的含量

实验二　Folin酚法(Lowry法)测定蛋白质的含量

【实验目的】

1．掌握Lowry法测定蛋白质含量的原理。

2．了解Lowry法的优缺点和适用范围。

【实验原理】

在强碱性溶液中，双缩脲(NH₂-CO-NH-CO-NH₂)与CuSO₄生成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有酰胺基或两个直接连接的肽键的物质都有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性环境下也能与铜离子发生双缩脲反应。

Folin酚甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠络合铜盐溶液起作用，生成紫红色蛋白质-铜络合物。

Folin酚乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在pH=10的碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)，显色随时间不断加深。在一定的反应时间和蛋白浓度范围内，蛋白质的含量与蓝色深浅成正比。因此可以通过可见光分光光度计测定650 nm处的光吸收值，利用标准曲线法测定蛋白质的浓度。

Lowry法的优点:灵敏度高，最低能检测0．005 mg/ml的蛋白质，通常检测范围是0．02～0．25 mg/ml;也适用于测定酪氨酸、色氨酸的含量。

Lowry法的缺点:费时;因为显色随时间不断加深，需要精确控制操作时间，以保证每管的显色时间一致;专一性较差，干扰物质较多。干扰双缩脲反应的基团(如-CO-NH₂、-CH₂-NH₂、-CS-NH₂)以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂(如Tris缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物)均可干扰Lowry反应。此外，干扰酚类呈色反应的酚类及柠檬酸也影响实验结果。浓度较低的尿素(约0．5%左右)、胍(0．5%左右)、硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯乙酸(0．5%)、乙醇(5%)、乙醚(5%)、丙酮(0．5%)等溶液对显色无影响。这些物质浓度高时，必须做校正曲线。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

因为Folin酚乙试剂仅在酸性pH值条件下稳定，而双缩脲的还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin酚乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。

【实验器材】

研钵、冰盒及玻棒、50 ml离心管、冷冻离心机、50 ml量筒、试管和试管架、移液器和枪头、可见光分光光度计。

【药品试剂】

1．小白菜。

2．浓度为0．25 mg/mL的标准蛋白质溶液。

3．待测蛋白质溶液。

4．Folin酚试剂甲:每次使用前，将50份(a)与1份(b)混合，即为试剂甲。

(a)将10 g Na₂CO₃、2 g NaOH和0．25 g酒石酸钾钠(NAC₄H₄O₆·4H₂O)溶解于蒸馏水中，然后定容到500 ml。

(b)0．5 g硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)溶解于蒸馏水中，然后定容到100 ml。

5．Folin酚试剂乙:在2 L磨口回流瓶中，加入100 g钨酸钠(Na₂Wo₄·2H₂O)，25 g钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)及700 ml蒸馏水，再加50 ml 85%磷酸，100 ml浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150 g硫酸锂(Li₂SO₄)，50 ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1 L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1 mol/L左右。

【实验方法】

1．制备总蛋白样品:称取小白菜10 g，在研钵中碾成匀浆，加水10 ml后继续碾10分钟，倒入离心管中，另加20 ml水将研钵中的剩余物洗入离心管，5000 r/min离心10分钟。取上清液10 ml定容到50 ml，此为待测蛋白质样品。

2．制备标准蛋白质浓度曲线和测定待测样品:标记试管，按表3-3依次向试管中加入各溶液，充分混匀。取玻璃比色杯，以0管作为零测定溶液在650 nm下的光吸收值。实验需要精确控制操作时间，具体操作如下:在试管中加入终体积为1 ml的标准蛋白水溶液。第1支试管加入5 ml试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5 ml试剂甲，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0．5 ml试剂乙，立刻混匀;1分钟后第2支试管加入0．5 ml试剂乙，2分钟后加第3支试管，以此类推。待最后一支试管加完试剂后，30℃放置20分钟，然后开始测定650 nm光吸收。每分钟测定一个样品。

表3-3　　　　　　　Lowry法实验设计表

3．数据处理:以蛋白质浓度(mg/ml)为横坐标，光吸收值(A₂₈₀)为纵坐标做标准曲线。从标准曲线上查出稀释后的样品浓度，乘以稀释倍数后计算样品溶液的实际浓度，求三个稀释倍数样品的平均值。

【注意事项】

1．待测样品1、2、3应为不同稀释倍数，样品量X1+水量Y1= 1 ml;

2．加入试剂甲或者试剂乙后，需立刻混匀，方能保证反应正常进行。

3．精确控制反应时间，保证每管反应时间一致。

【思考题】

1．简述Folin酚法测蛋白质含量的优缺点。

2．Folin酚法测定蛋白质含量时有哪些注意事项?