不连续-垂直电泳及考马斯亮蓝染色法

实验六　不连续SDS-PAGE垂直电泳及考马斯亮蓝染色法

【实验目的】

1．掌握SDS-PAGE的基本原理。

2．掌握垂直板状凝胶电泳槽的使用和凝胶配制方法。

3．掌握考马斯亮蓝法对SDS聚丙烯酰胺凝胶染色的方法。4．了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围。

【实验原理】

带电颗粒在电场的作用下，向与其电荷相反的电极方向移动的现象称为电泳(electrophoresis)。电泳的速度与带电颗粒的电荷强弱、分离介质的阻力、电解液的黏度和电场强度等因素相关。生物大分子电泳的速度除上述因素之外，还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质和数目等因素有关。基于各种带电粒子在电场中迁移速度的不同，可将蛋白质、核酸等物质进行分离，此实验技术称为电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺，在催化剂(化学聚合剂过硫酸铵或光聚合剂核黄素)和加速剂(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)的作用下聚合含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构的凝胶。改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例，就可以得到不同孔径的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，可用来分离核酸(＜3%)和蛋白质(7%～15%)。待分离分子通过凝胶孔的能力取决于凝胶孔的大小和形状，也取决于被分离分子的形状、大小以及分子所带的电荷等因素。

蛋白质是两性电解质分子，大多数蛋白质的等电点在5左右，在pH6～8的聚丙烯酰胺凝胶中带有负电荷，在电场中能向正极迁移。由于相对分子质量的不同和蛋白质形状以及所带静电荷的多少等因素的差异，不同蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度也有所差异，从而使不同性质的蛋白质得以分离。

PAGE分离蛋白质基于三种物理效应:

1．凝胶对蛋白质样品的分子筛效应:聚丙烯酰胺凝胶是三维网状结构的凝胶。分子量大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞的阻力大，移动慢;分子量小、球形的分子移动快。

2．电荷效应:大部分蛋白质在pH8．3电泳缓冲液的条件下带有负电荷，蛋白质的等电点决定了自身表面带的负电荷的多少。表面负电荷多的蛋白质迁移快，表面负电荷少的蛋白质则迁移速度较慢。

3．不连续系统对蛋白质样品的浓缩效应:PAGE电泳根据凝胶的分离系统可以分为连续系统和不连续系统。不连续的SDS-PAGE系统具有较强的浓缩效应，因此比连续系统电泳的分辨率高，也更为常用。在无特殊说明的情况下，SDS-PAGE均指不连续的SDS-PAGE系统。该凝胶系统存在三个不连续:凝胶层的不连续;缓冲液离子成分及pH值的不连续和电位梯度的不连续。

凝胶层的不连续表现为聚丙烯酰胺凝胶分为上下两层胶，上层胶称为浓缩胶，聚丙烯酰胺浓度较低，凝胶孔径较大;下层胶称为分离胶，聚丙烯酰胺浓度较高，凝胶孔径较小。蛋白质颗粒在大孔径胶中泳动时阻力小，移动速度快;而在小孔径胶中泳动时阻力较大，移动速度慢。因此，在不连续的两层凝胶交界处，样品迁移受阻被压缩(浓缩)成很窄的区带。

缓冲液离子成分及pH值的不连续性表现为浓缩胶(pH6．8)和分离胶(pH8．8)中含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)及HCl。Tris是缓冲离子，能维持溶液的pH值。HCl在溶液中解离成Cl^－，在电场中迁移速率很快，在所有离子和分子的最前面，因此被称为快离子或前导离子。电泳缓冲液中含有的甘氨酸成分在pH6．8的浓缩胶和pH 8．3的缓冲体系中解离度很小，因此迁移率很低，被称为慢离子或尾随离子。蛋白质在pH6．8的浓缩胶中有效迁移率介于快慢离子之间，在快慢离子间被浓缩成极窄的区带。当进入pH8．8的分离胶后，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，跑在蛋白质前面;而蛋白质由于分子量大而被留在后面，不再受离子界面影响，根据自身分子量的大小而分成多个区带。

为排除蛋白质分子之间的电荷差异及形状对蛋白质迁移的影响，使其迁移的大小只取决于相对分子质量的大小，Shapiro和Weber等人(1967)发现在PAGE胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS)能达到此目的，并能用PAGE测定蛋白质的相对分子质量。含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳被称作SDSPAGE。在SDS-PAGE系统中加入了变性剂巯基乙醇和去污剂SDS。巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原;而SDS是一种强阴离子去污剂，能与蛋白质成比例结合，破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子间的共价键;使蛋白质变性，使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，去折叠，而改变原有的空间构象;同时使蛋白质带上大量负电荷，导致不同蛋白质之间自身电荷差别消失。因此SDS-PAGE分离蛋白质主要依赖蛋白质自身分子量的差异，而非电荷或形状。

SDS-PAGE分离胶丙烯酰胺的浓度和蛋白质大小分离范围间的关系见表3-7所示:

表3-7　　　　　　　SDS-PAGE分离胶丙烯酰胺的浓度和蛋白质大小分离范围

当蛋白质的相对分子量在凝胶的分离范围之内时，蛋白质电泳迁移率m_R与相对分子量Mr的对数呈线性关系，符合如下方程:

lgMr=K－b·m_R

其中:b为斜率;K为截距;在一定条件下b和K均为常数。蛋白质电泳迁移率m_R是用蛋白质条带的迁移距离除以溴酚蓝条带前沿的迁移距离得到的，即

如果凝胶厚度＞lmm，由于染色、脱色和保存过程中，凝胶的膨胀或收缩将影响迁移率的变化，因此必须测量固定前和脱色后的凝胶的长度并按下式换算，以消除误差。

据此，可以将一系列已知Mr的标准蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离，然后以每个已知Mr的标准蛋白质的电泳相对迁移率为横坐标，以Mr的对数为纵坐标作图得出蛋白质Mr的标准曲线。同时将未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据电泳迁移率的测量计算结果，在标准曲线上求得相对分子量。

SDS-PAGE的优点:简便、快速、重复性好;样品用量少，可同时测定多种样品的分子量;分辨率高:蛋白质分离范围为10000～200000 kU，可通过调节凝胶浓度来使蛋白质分离达到最佳效果。

几乎所有的蛋白质分析电泳都采用PAGE电泳。SDS能确保蛋白质解离成单个多肽亚基，并尽可能减少亚基之间的相互聚集，因此如果蛋白质是由多亚基组成时，则SDS电泳所测得的蛋白质相对分子量为亚基的分子量而不是天然蛋白质的分子量。

蛋白质对考马斯亮蓝的吸附与蛋白质的量大致成正比，因此可以用考马斯亮蓝染料对电泳后的蛋白质条带进行染色。

蛋白质样品制备应注意保持低温以避免蛋白质降解或修饰，在合适的盐离子浓度条件下保持蛋白质的最大溶解度和可重复性。

【实验器材】

电泳仪、垂直板电泳槽、微量加样器、50 ml烧杯两个、移液枪等。

【药品试剂】

1．5×电泳缓冲液储存液(pH8．3):取Tris 7．5 g，甘氨酸36 g，SDS 2．5 g，加水溶解后定容为500 ml。使用前稀释5倍。

2．TEMED(四甲基乙二胺)。

3．30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液:称取29．2 g丙烯酰胺和0．8 g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解后定容至100 ml，过滤备用，4℃储存。

4．分离胶Tris缓冲液(pH8．8):1．5 mol/L Tris-HCL，调整pH值为8．8。

5．浓缩胶Tris缓冲液(pH6．8):1 mol/L Tris-HCL，调整pH值为6．8。

6．10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)，配制后的10%溶液可以在4℃储存一周。

7．10%SDS。

8．2×上样缓冲液:将2 ml0．5 mol/L Tris-HCl(pH6．8)、2 ml甘油、2 ml 20%SDS，0．5 ml 0．1%溴酚蓝、1 ml巯基乙醇和双蒸水2．5 ml混合后，－20℃储存。

9．染色液:0．2 g考马斯亮蓝R250充分溶解在84 ml 95%乙醇和20 ml冰醋酸中，定容至200 ml，过滤备用，室温保存。

10．0．1%SDS。

11．蛋白分子量标准液(商品化):根据需要选择合适的蛋白质分子量标准溶液。在蛋白质分子量标准溶液中混合已知分子量的多种蛋白质成分。

12．待测混合蛋白质。

【实验方法】

1．SDS-PAGE凝胶的制备:

(1)安装玻璃板:将玻璃板清洗干净，吹风机吹干或竖直自然晾干。将长玻璃板平放于桌面上，带玻璃侧条面向上。把橡皮胶条沿玻璃板侧缘和下缘放置好，然后将带凹槽的短玻璃板放置其上。将安好的长短玻璃板配套镶嵌入配胶架上，凹槽玻璃板朝外，夹入斜楔板固定。在长短玻璃板之间加入少量水，看是否有漏液情况。如漏液，需重新安装玻璃板。如不漏液，则可将水倒掉。在玻璃板之间插入梳子，在梳子下0．5～1cm处画线做标记。再取出梳子，继续下述步骤。

(2)配制分离胶:按表3-8所示依次在烧杯中加入水、30%丙烯酰胺溶液、pH8．8的1．5 mol/L Tris-HCl缓冲液、10%SDS、10%过硫酸铵，依次混匀后加入加速剂TEMED，迅速混匀并灌入两玻璃板间，直至标记处。随后在凝胶液上加2 ml 0．1%SDS溶液覆盖，以避免凝胶干燥。常温聚合1小时左右。室温低于20℃时，可将凝胶放入37℃烘箱以加速聚合。

表3-8　　　　　　　SDS-PAGE中分离胶的制备

(3)配制浓缩胶:待分离胶凝固之后，可见胶面与表层溶液有清晰分界面。倾去表层的溶液，用滤纸吸干残余溶液，注意勿接触胶面。按表3-9所示依次在烧杯中加入水、30%丙烯酰胺溶液、pH6．8的1 mol/L Tris-HCl缓冲液、10%SDS、10%过硫酸铵，依次混匀后加入加速剂TEMED，迅速混匀并灌入两玻璃板间。随后立刻在凝胶液上插入梳子，梳子平的一侧面对长玻璃板，注意避免插入气泡。常温聚合30分钟左右。室温低于20℃时，可将凝胶放入37℃烘箱以加速聚合。

表3-9　　　　　　　SDS-PAGE凝胶中浓缩胶的制备

(4)将凝固好的玻璃板从配胶架上取下来，轻轻取出梳子和橡皮胶条，然后把带胶的玻璃板凹槽短玻璃板向内插入电泳槽架上，固定。并在玻璃板之间形成的内槽和外槽中加入电泳缓冲液，内槽液面需淹没过玻璃板上缘，外槽液面需淹没过玻璃板下缘数厘米。

2．蛋白样品的处理:取待测样品20μl，加入等量2×上样缓冲液，95℃加热5分钟，取出冷却至室温。

3．上样:用微量加样器吸取蛋白分子量标准液和待测样品20μl，分别加入梳孔中。

4．电泳:加样完毕后，上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪，调整电压至75 V，恒压电泳15～20分钟直至样品中溴酚蓝带形成一条直线，并且处于浓缩胶和分离胶的分界线处。调整电压至130 V，恒压电泳，直至溴酚蓝条带跑到距离凝胶底部约0．5 cm处停止电泳。

5．染色:取出玻璃板，用拨胶板小心撬开短玻璃板，并将浓缩胶去掉，将分离胶部分置于平皿中，用直尺测量凝胶长度和溴酚蓝的迁移距离并记录，然后加入适量考马斯亮蓝染色液淹没过胶面，置于摇床上常温染色5小时以上。

6．脱色:染色完毕后，倒出染色液，倒入脱色液常温脱色3～6小时，其间更换脱色液3～4次，直至凝胶的蓝色背景褪去，蛋白质区带清晰为止。用直尺测量凝胶脱色后的长度以及各蛋白样品带的迁移距离。

7．蛋白相对分子量的计算:首先计算各蛋白质的相对迁移率，然后以各标准蛋白质样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，绘制出一条标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率的数值，可以直接从标准曲线上查得蛋白质的Mr。

8．蛋白质浓度的估算:将脱色后的凝胶进行照相或扫描。用Photoshop对不同浓度的BSA蛋白条带的灰度以及待测蛋白条带的灰度进行量化计算，以BSA蛋白浓度为横坐标，灰度为纵坐标，在坐标纸上做标准曲线，根据测算出的待测蛋白条带灰度，可以大致估算出蛋白质的浓度。

【思考题】

1．SDS-PAGE法测蛋白质分子量和含量的优缺点各有哪些?

2．简述SDS-PAGE法的用途。