连续的非变性凝胶电泳法

实验五　连续的非变性凝胶电泳法

【实验目的】

1．掌握非变性凝胶电泳的基本原理。

2．了解非变性凝胶电泳的应用范围。

【实验原理】

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)是在不加入SDS、巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持生物大分子结构和活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。未加入SDS的电泳条件可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，而不含巯基乙醇等变性剂也能使蛋白质各亚基间的相互作用得以保存。这种非变性条件下的电泳依据蛋白质、酶等生物大分子电泳迁移率的不同和凝胶分子筛的作用，将保持生物活性的大分子进行电泳分离。

非变性凝胶电泳适合于进行生物大分子亚基聚合状态分析、蛋白相互作用分析、酶活性分析等。

一般蛋白质进行非变性凝胶电泳时要分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白的时候，要利用低pH值凝胶系统，使蛋白质带正电荷，通常需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离。分离酸性蛋白质的时候，通常采用高pH值凝胶缓冲系统(如pH8．3)，使蛋白质带负电荷，蛋白质可以向阳极迁移。

【实验器材】

电泳仪、垂直板电泳槽、微量加样器、50 ml烧杯1个、移液枪等。

【药品试剂】

1．10×TBE(pH8．3):取Tris 108 g，Na₂EDTA·2H₂O7．44 g，硼酸55 g，加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解，定容至1 L。室温存放。

2．30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液:称取29．2 g丙烯酰胺和0．8 g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解后定容到100 ml，过滤备用，4℃储存。

3．2×溴酚蓝上样缓冲液:1．25 ml pH6．8 0．5 mol/L Tris-HCl，3 ml甘油，0．2 ml 0．5%溴酚蓝，5．5 ml双蒸水;－20℃储存。

4．10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)。

5．TEMED。

6．考马斯亮蓝染色液:0．2 g考马斯亮蓝R250溶于84 ml 95%乙醇，加入20 ml冰醋酸，充分混匀后定容到200 ml，过滤备用。

7．考马斯亮蓝脱色液:100 ml甲醇，100 ml冰醋酸，800 ml dH₂O，混匀备用。

8．2．5 mg/ml标准蛋白质溶液(商品化产品)。

9．待测混合蛋白质。

【实验方法】

1．安装玻璃板，过程同SDS-PAGE(参见本章实验六)。

2．按照表3-6配制8%的非变性凝胶10 ml，倒入玻璃板之间，尽快插入梳子。室温下聚合30～40分钟。

表3-6　　　　　　　非变性凝胶的制备

3．取出梳子，将玻璃板凹槽向内重新安装到电泳槽上，内外槽分别加入1×TBE缓冲液。

4．样品加等体积上样缓冲液，每孔点样10μl，140 V电泳约90分钟。

5．取出玻璃板，小心剥胶，并随后进行考马斯亮蓝染色和脱色，过程同SDS-PAGE(参见本章实验六)。

【思考题】

简述非变性凝胶电泳的用途。