三聚氰胺的测定

国家标准方法推荐采用高效液相色谱法测定三聚氰胺。GB/T22388—2008适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定(高效液相色谱测定方法)，定量限为2mg/kg。

1.原理

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用HPLC测定，外标法定量。

2.试剂与材料

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

①色谱纯试剂: 甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠; 氨水(含量为25% ～28%)、三氯乙酸、柠檬酸。

②甲醇水溶液: 准确量取50m L甲醇和50m L水，混匀后备用。

③三氯乙酸溶液(1%): 准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

④氨化甲醇溶液(5%): 准确量取5m L氨水和95m L甲醇，混匀后备用。

⑤离子对试剂缓冲液: 准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980m L水溶解，调节p H至3.0后，定容至1L备用。

⑥三聚氰胺标准品: CAS108-78-01，纯度大于99.0%。

⑦三聚氰胺标准储备液: 准确称取100mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品于100m L容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/m L的标准储备液，于4℃避光保存。

⑧阳离子交换固相萃取柱: 混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，填料质量为60mg，体积为3m L，或相当者。使用前依次用3m L甲醇、5m L水活化。

⑨海砂: 化学纯，粒度0.65～0.85mm，二氧化硅(Si O2)含量为99%。

⑩定性滤纸及0.2μm有机相微孔滤膜。

3.仪器和设备

高效液相色谱(HPLC)仪: 配有紫外检测器或二极管阵列检测器、分析天平(感量为0.0001g和0.01g)、离心机(转速不低于4000r/min)、超声波水浴、固相萃取装置、氮气吹干仪、涡旋混合器、50m L具塞塑料离心管、研钵。

4.样品处理

1)提取

(1)液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等

称取2g(精确至0.01g)试样于50m L具塞塑料离心管中，加入15m L三氯乙酸溶液和5 m L乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25m L，移取5m L滤液，加入5 m L水混匀后做待净化液。

(2)奶酪、奶油和巧克力等

称取2g(精确至0.01g)试样于研钵中，加入适量海砂(试样质量的4～6倍)研磨成干粉状，转移至50m L具塞塑料离心管中，用15m L三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5m L乙腈，余下操作同(1)中“超声提取10min，……加入5m L水混匀后做待净化液”。

注: 若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。

2)净化

将上述步骤中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3m L水和3m L甲醇洗涤，抽至近干后，用6m L氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1m L/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物(相当于0.4g样品)用1m L流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

5. 高效液相色谱测定

1)HPLC参考条件

(1)色谱柱

C8柱，250mm×4.6mm，内径5μm，或相当者。

C18柱，250mm×4.6mm，内径5μm，或相当者。

(2)流动相

C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈(85+15，体积比)，混匀。

C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈(90+10，体积比)，混匀。

(3)其他条件

流速: 1.0m L/min; 柱温: 40℃; 波长: 240nm; 进样量: 20μL。

2)标准曲线的绘制

用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8 μg/m L，2 μg/m L， 20μg/m L，40μg/m L，80μg/m L的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图参见图12-8。

图12－8 基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图

(检测波长240nm，保留时间13.6min，C8柱)

3)定量测定

待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

4)结果计算

式中: X——试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

A——样液中三聚氰胺的峰面积;

c——标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升(μg/m L);

V——样液最终定容体积，单位为毫升(m L);

As——标准溶液中三聚氰胺的峰面积;

m——试样的质量，单位为克(g);

f——稀释倍数。

6.空白实验

除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。

7.方法定量限、回收率、允许差

本方法的定量限为2mg/kg; 在添加浓度2～10mg/kg浓度范围内，回收率在80% ～110%之间，相对标准偏差小于10%; 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。