中华管鞭虾多酚氧化酶生化特性研究

中华管鞭虾多酚氧化酶生化特性研究

郑斌　杨会成＊　郝云彬　钟明杰　周宇芳　付万冬　廖妙飞　吴亮亮

［作者简介］浙江省海洋开发研究院，浙江舟山，316100。＊通讯作者。

［基金项目］浙江省水产品加工产业创新团队（2009R50031）。

［原载期刊］《浙江海洋学院学报（自然科学版）》2011年第6期。本文有删改。

海捕虾类以其含有蛋白质、微量元素及生理活性物质等丰富营养物质，其特有呈味物质所产生的口味与人们的最佳味觉非常吻合，味道鲜美，深受人们喜爱。但由于其体内的多酚氧化酶（PPO）引起一系列生化反应，在壳体上产生黑色素沉淀，即形成黑点［1］。壳上的黑点严重影响外观，同时也制约着它的商品价值。多酚氧化酶天然地存在于甲壳内和甲壳下面的组织中，这种酶在冷冻、冰贮和解冻期间仍然保持着活性［2］。目前，一般使用焦亚硫酸钠处理海捕虾黑变症状［3］，但是焦亚硫酸钠处理的虾类产品中二氧化硫严重超标。

为了从根本上解决海捕虾等甲壳类产品的保鲜防黑变问题，本文选取东海区海捕虾中重要的种类——中华管鞭虾（Solenocera crassicornis）为研究对象，研究了其多酚氧化酶的分离纯化和各种成分对酚氧化酶的影响，以提取的多酚氧化酶液作为研究对象，对其重要的生化特性进行了研究，以期为开发新型海捕虾防黑变保鲜剂奠定理论基础。

1材料和方法

1．1原料

新鲜中华管鞭虾购自舟山国际水产城。

1．2主要试剂

L－DOPA，儿茶酚，胰凝乳酶，β－葡聚糖，4－己基间苯二酚（4－HR），苯酚，十二烷基硫酸钠（SDS），十二烷基磺酸钠，氯化钠，氯化钙，氢氧化钠，碳酸钠，L－维生素C、EDTA二钠、柠檬酸、山梨酸、碳酸镁、硫酸铜、硫酸铜等所用化学试剂均为分析纯。

1．3主要仪器与设备

TU1800PC分光光度计；恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；p H计（梅特勒—托利多仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1．4方法

1．4．1粗酶的制备

称取半解冻后的样品5 g，加入p H为7．0的预冷Tris－HCl缓冲液10 mL，震荡仪震荡3 min，低温超声提取5 min，1℃下静置4 h，10000 r／min离心10 min，所得上清液即为粗酶液。

1．4．2酚氧化酶的活性测定

参照ASHIDA等［4］的方法，以及国内其他文献采用的方法，并略做调整。以L－DOPA为特异性底物测定酚氧化酶的活性。具体测定时，取待测酶液100μL，与100μL 0．015 mol／L的L－DOPA充分混匀，于40℃恒温水浴中反应40 min后，加入2．8 m L预冷的纯净水终止反应。用分光光度计测定490 nm处的吸光值。每1 min吸光值增加0．001定义为1个酶活性单位（A 490·103／min）。

1．4．3 p H值对酶活性的影响

取适量p H值为5．0、6．0、7．0、8．0、9．0和10．0的缓冲液放置在1℃的环境下预冷。同时，取待测酶液100μL，与100μL 0．015 mol／L的L－DOPA充分混匀，于40℃恒温水浴中反应。40 min后，加入0．28 m L预冷的缓冲液终止反应。用TU1800PC分光光度计测定490 nm处的光吸收。每1min吸光值增加0．001定义为1个酶活性单位（A 490·103／min）。

1．4．4温度对酶活性的影响

取待测酶液100μL，与100μL 0．015 mol／L的L－DOPA充分混匀，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下恒温水浴中反应。40 min后，加入2．8 m L预冷的纯净水终止反应。分别对酚氧化酶的活性进行测定，以确定其最适反应温度。

1．4．5酚氧化酶的底物特异性

配置浓度均为0．015 mol／L的L－DOPA、儿茶酚、对苯二酚和苯酚。

分别取待测酶液100μL，与100μL 0．015 mol／L的L－DOPA、儿茶酚、对苯二酚和苯酚充分混匀，于40℃恒温水浴中反应40 min后，加入2．8 m L预冷的纯净水终止反应。用分光光度计测定490 nm处的光吸收。

1．4．6酚氧化酶的酶学动力学性质

以L－DOPA为底物，所用浓度分别为1 mmol／L、2 mmol／L、3 mmol／L、5 mmol／L、7．5mmol／L、10 mmol／L、12．5mmol／L和15 mmol／L。取待测酶液100μL，与100μL不同浓度的L－DOPA充分混匀，于40℃恒温水浴中反应40 min后，加入2．8m L预冷的纯净水终止反应。用TU1800PC分光光度计测定490 nm处的光吸收（以实验条件下每min A 490增长0．001定义为一个酶活力单位，即A 490·103／min）。对所得到的A 490值使用Lineweaver－Burk双倒数作图法绘制出酚氧化酶的动力学曲线，并根据Wilkinson法计算其Km值。

1．4．7酚氧化酶的激活

（1）自然条件下的激活

在不使用激活剂的情况下，酚氧化酶通过适度加热、与空气接触等都可以被激活。新提取的酚氧化酶在1℃冷柜中短期保存的情况下，有一个缓慢的激活过程。为此，每隔8 h测定一次1℃条件下保存的酚氧化酶的活性变化，探索1℃条件下酚氧化酶的活性变化规律。

（2）使用激活剂激活酚氧化酶

分别配置10 mmol／L的胰凝乳酶、β－葡聚糖、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基磺酸钠、氯化钠、氯化钙、氢氧化钠、碳酸钠、硫酸镁溶液。

取新提取的粗酶液100μL，分别加入10 mmol／L的胰凝乳酶、β－葡聚糖、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基磺酸钠、氯化钠、氯化钙、氢氧化钠、碳酸钠、硫酸镁溶液100μL，于40℃恒温水浴中反应20 min后，加入100μL 15 mmol／L的L－DOPA溶液，再次放入40℃恒温水浴中反应20 min后，加入2．7 m L预冷的纯净水终止反应。测定490 nm处的光吸收。

对照管采用100μL纯净水代替激活剂，其他条件不变。

1．4．8酚氧化酶的抑制

分别配置具有一定质量浓度梯度序列的山梨酸、柠檬酸、L－抗坏血酸、EDTA二钠、碳酸镁、硫酸铜、4－己基间苯二酚和硫脲等酚氧化酶抑制剂。

取经过活化处理的酚氧化酶提取液100μL，分别加入配好的一定浓度的抑制剂100μL，于40℃恒温水浴中反应20 min后，加入100μL 15 mmol／L的L－DOPA溶液，再次放入40℃恒温水浴中反应20 min后，加入2．7 mL预冷的纯净水终止反应。测定490 nm处的光吸收。

对照管采用100μL纯净水代替抑制剂，其他条件不变。

2结果分析

图1　不同p H值对酚氧化酶活性的影响

2．1酚氧化酶的最适反应p H

图1是在不同p H值环境条件下的酶活性测定结果。从图中可以看出，p H为8．0时酚氧化酶活性最高。而在p H低于8．0时，酚氧化酶活性随着p H值的升高而逐渐升高；在p H等于8．0时达到峰值；当p H超过8．0后，酚氧化酶活性又随着p H值的升高而逐渐降低。因此，中华管鞭虾酚氧化酶对L－DOPA的最适p H为8．0。

2．2酚氧化酶的最适反应温度

图2是不同温度条件对酚氧化酶活性的影响。从图中可以看出，45℃时的酚氧化酶的活性最高。当温度在25～45℃时，酚氧化酶的活性随着温度的升高而逐渐升高；超过45℃以后，酚氧化酶的活性则随着温度的升高而迅速降低；在60℃时酚氧化酶活性仅为45℃时的18．9%。因此，以L－DOPA为底物，中华管鞭虾的最适反应温度为45℃。

2．3酚氧化酶的底物特异性

由图3可以看出，酚氧化酶能够氧化L－DOPA和儿茶酚。但不能氧化对苯二酚和苯酚。

图2　不同温度对酚氧化酶活性的影响

图3　酚氧化酶的底物特异性

2．4酚氧化酶的酶动力学性质

如图4所示，利用Lineweaver－Burk双倒数作图法绘制酶动力学曲线。经测试，在40℃、p H 8．0时（优化试验后酚氧化酶的提取p H值定为8．0），中华管鞭虾酚氧化酶对L－DOPA的Km值为4．70 mmol／L。

图4　酚氧化酶的酶动力学曲线

2．5酚氧化酶的激活

2．5．1自然条件下激活

如图5所示，由于中华管鞭虾酚氧化酶绝大多数以酚氧化酶原的形式存在，因此经提取后，放置在1℃环境下会发生激活反应。随着贮存时间的延长，在48小时内，酚氧化酶的活性逐渐增大。但酶的激活和失活是同时存在的，当一段时间后，酶的失活速度大于能够激活的酶的激活速度时，酶的活性开始降低。对保存在1℃条件下的管鞭虾酚氧化酶而言，这个临界点在48小时附近。其中，40小时时的酶活性是48小时时的95．6%；56小时时的酶活性是48小时时的94．1%。而32小时和64小时时的酶活性为48小时时的80%以上，但不足85%。为了保证试验的稳定，实验测定应尽量在酶的活性最大的一段时间内进行。因此，自然激活条件下，应尽量在酶提取后40小时到56小时这一时间段内进行。

图5　酚氧化酶1℃条件下的活性变化

2．5．2激活剂对酚氧化酶的激活

在试验所选的激活剂中，氯化钠、氢氧化钠和碳酸钠对管鞭虾酚氧化酶的活性没有明显影响。胰凝乳酶、β－葡聚糖、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基磺酸钠、氯化钙和硫酸镁对中华管鞭虾酚氧化酶的激活作用，如图6所示。其中，十二烷基硫酸钠（SDS）对酚氧化酶的激活作用最大，激活率为71．9%；其次为胰凝乳酶，对中华管鞭虾酚氧化酶的激活率为62．4%；β－葡聚糖的激活率为33．4%；其他均不足30%。

图6　不同激活剂对酚氧化酶的激活效果

从图5和图6可以看出，将新提取的中华管鞭虾酚氧化酶在1℃放置40h能达到很好的激活效果。其激活效果好过使用化学激活剂。因此实验测定应尽量使用提取出静置激活40～56h的酚氧化酶粗酶液。

2．6抑制剂对酚氧化酶的抑制作用

利用配置一定质量浓度序列的山梨酸、柠檬酸、L－抗坏血酸、EDTA二钠、碳酸镁、硫酸铜、4－己基间苯二酚［3，5，6］和硫脲等抑制剂进行抑制试验发现，同一质量浓度时不同抑制剂具有不同的抑制效果。其中，同一质量浓度时，4－己基间苯二酚具有最大的抑制效果，其次为EDTA二钠。通过表1得出4－己基间苯二酚对中华管鞭虾的抑制作用最为强烈。其次依次为硫酸铜、EDTA二钠、L－抗坏血酸、柠檬酸、硫脲、山梨酸，测试样品中对中华管鞭虾酚氧化酶抑制效果最弱的是碳酸镁。

表1　各种酚氧化酶抑制剂对酚氧化酶活性的影响

3结论

本文通过对中华管鞭虾多酚氧化酶的活性进行研究，得出以下结论。

中华管鞭虾酚氧化酶的最适反应温度为45℃，当温度超过50℃酶反应呈现出不稳定性，温度超过55℃则酶反应速率迅速下降。同时，得出酚氧化酶的最适反应p H为8．0。40℃、p H 8．0条件下的中华管鞭虾酚氧化酶的Km值为4．70 mmol／L。

在激活剂对中华管鞭虾酚氧化酶的激活试验中，氯化钠、氢氧化钠和碳酸钠对管鞭虾酚氧化酶的活性没有明显影响。胰凝乳酶、β－葡聚糖、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基磺酸钠、氯化钙和硫酸镁等对中华管鞭虾酚氧化酶有明显的激活作用。其中，十二烷基硫酸钠（SDS）的激活作用最大，激活率为71．9%；其次为胰凝乳酶，激活率为62．4%；β－葡聚糖的激活率为33．4%；其他均不足30%。

研究表明，4－己基间苯二酚对中华管鞭虾的多酚氧化酶抑制作用最为强烈。另外，对于传统的抑制剂硫酸铜、EDTA二钠、L－抗坏血酸、柠檬酸和硫脲等也具有较强的抑制作用，这与陈丽娇［5］、汪小锋［6］等和赵晓［7］等的研究结果类似。

参考文献

［1］MONTERO P，AVALOS A，PEREZ－MATEOS M．Characterization of Polyphenoloxidase of Prawns （Penaeus japonicus），Alternatives to Inhibition：Additives and High－pressure Treatment［J］．Food Chemistry，2001（75）：317—324．

［2］MARTINEZ－ALVAREZ O，LOPEZ－CABALLER M E，et al．Spraying of 4－hexylresorcinol Based Formulations to Prevent Enzymatic Browning in Norway Lobsters During Chilled Storage［J］．Food Chemistry，2007（100）：147—155．

［3］MENDES R，PESTANA J．Changes in 4－Hexylresorcinol Residues During Processing of Deepwater Pink Shrimp［J］．Eur Food Res Technol，2006（223）：509—515．

［4］ASHIDA M，DOHKE K．Activation of Prophenoloxidase by the Aetivating Enzyme of the Silkworm，Bombyx mori［J］．Insect Bioehem，1980（10）：37—47．

［5］陈丽娇，郑明锋，李怡宾．南美白对虾多酚氧化酶的生化特性［J］．福建农林大学学报（自然科学版），2004（9）：377—380．

［6］汪小锋，樊廷俊．中国对虾酚氧化酶的部分生物化学特性的初步研究［J］．海洋科学，2003，27（4）：71—75．

［7］赵晓，戚晓玉．日本对虾的酚氧化酶特性的研究［J］．上海水产大学学报，1997，6（3）：157—165．