紫外辐射对爪哇伪枝藻生理生化特性和超微结构的影响

紫外辐射对爪哇伪枝藻生理生化特性和超微结构的影响_荒漠藻类对紫外辐

一、材料和方法

1.材料培养与UV辐射强度设置

爪哇伪枝藻［Scytonema javanicum(Kütz.)Born et Flah］从宁夏自治区中卫县沙坡头生物结皮中分离、纯化所得。采用BG110液体培养基(Rippka et al.，1979)(成分和配制方法见表2-1)培养，光照强度30～40μE/m2·s，24h连续光照，25±1℃，三角瓶中通气培养至对数生长期，然后转接到培养皿中。处理组和对照组均采用白光光源，光强为30～40μE/m2·s，用光照强度计(JD23型，上海市嘉定学联仪表厂)测定光强，处理组补加UV-A或UV-B光源，25±1℃下连续光照培养。以法国Cole-Parmer Instrument公司产的9815-00型紫外灯(15W)提供UV-B光源(波长312nm)，CAT.N0型照度计测量光强;UV-A光源采用美国Spectronics公司产的紫外灯(15W)提供，UV-A照度计(DRC-100X，Spectronics Corporation Westbuty，New York，USA)测量光强。

测得野外试验地中午12:00地表UV辐射平均值分别为:UV-A，1.48mW/cm2;UV-B，0.25mW/cm2。本研究中采用的辐射强度分别为:UV-A，0.2mW/cm2、0.4mW/cm2、0.8mW/cm2和1.6mW/cm2;UV-B，0.06mW/cm2、0.12mW/cm2、0.24mW/cm2和0.48mW/cm2。强度大小没有特别说明时，UV-A为1.6mW/cm2，UV-B为0.24mW/cm2。

2.UV辐射对S．javanicum生长的影响

用分光光度计(Pharmacia Biotech，Ultrospec 3000)测定665nm处的光吸收值(OD665)，作OD665-时间曲线，表示S．javanicum的生长。

表2-1　BG11培养基的成分和配制方法

a BG110培养基不加NaNO3;b EDTA为二乙胺四乙酸二钠;c A5微量元素混合液的成分(g/L):H3 BO3，2.86;MnCl2·4H2 O，1.81;Na2 MoO4·2H2 O，0.039;ZnSO4·7H2 O，0.222;Cu-SO4·5H2 O，0.079;Co(NO3)2·6H2 O，0.0494。

3.生物量的测定

取20mL藻液，5000r/min离心10min，弃去上清液，将藻体于80℃下烘至恒重，于干燥器中冷却，在分析天平(Libror Aeg-220g，Shimadzu Corporation，Japan)上称重。

4.叶绿素荧光的测定

叶绿素a荧光采用浮游植物效率分析仪(PHYTO-PAM，Walz GmbH，Germany)测定，测定在室温中进行。

5.光合放氧的测定

取培养物2mL用溶氧测定仪(SP-3型，中国科学院植物生理生态所)测定放氧速率，光照强度为550μE/m2·s，水浴温度为25℃。放氧稳定后记录时间不少于6min。

6.可溶性蛋白质的测定

用考马斯亮蓝G-250法测定，以牛血清白蛋白为标样(Bradford，1976)。

考马斯亮蓝G-250溶液为100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%的乙醇中，然后加入100mL 85%(W/V)的磷酸，最后用蒸馏水定容至1L，储于棕色瓶中。

标准曲线的绘制。配制标准蛋白质溶液为100μg/mL的牛血清白蛋白溶液。向6支分别装有0mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL标准蛋白质溶液的离心管中，加入蒸馏水至1mL，混匀。分别取50μL上述溶液于酶标板中，然后各加入250μL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀。用酶标仪(Sunrise Remote/Touch Screen，Tecan Austria GabH，Austria)测定595nm处的吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

取10mL培养物，冰水浴下超声仪(Ce Converter120C，Branson Digital Sonifier®，Mexico)超声破碎，离心(8 000r/min，10min)，弃去沉淀物。取50μL经适量稀释的上清液于酶标板中，然后加入250μL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀。于酶标仪上测定595nm处的吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量，按公式计算:

样品中蛋白质的含量=C×V T/(V S×W F×1000)(mg/g)其中，C为查得标准曲线值，μg;V T为提取液总体积，mL;W F为样品鲜重，g;V S为测定时加样量，mL。

7.叶绿素a(Chl a)、伪枝藻素(Scytonem in)和类胡萝卜素(CAR)的测定

取约1g培养物，离心后，弃去上清液，将藻细胞烘干。加入丙酮用研钵捣碎，4℃过夜后，用Whatman GF/C滤纸过滤，在6℃黑暗下，通过硅胶板的薄层层析(流动相为甲醇∶氯仿=1∶9的混合溶液)纯化。用分光光度计测定384nm、490nm和663nm处的光吸收值。按下列公式计算(Ferran＆Richard，1991):

8.藻蓝蛋白的测定

取培养物10mL，离心收集藻细胞，将藻细胞悬浮于等体积的pH=7.8的磷酸缓冲液，冰水浴下超声波破碎，离心(8000r/min，10min)，用分光光度计测定上清液在波长615nm和652nm处的光吸收值。按公式PC=(OD615-0.474×OD652)/5.34计算，单位:mg/mL(Bennet et al.，1973)。

9.多糖的提取与测定

分泌到培养基中的胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)的提取按陈兰周(2002)的方法进行。

藻细胞中的多糖提取采用Jarman et al.(1978)方法并加以修改。取20mL培养物，加入0.3M NaCl和0.03M Na-EDTA，并调pH=10，50℃水浴保温10min，GF/CWhatman玻璃纤维滤膜过滤去除藻渣，向滤液中加入3倍体积的丙二醇，再过GF/CWhatman玻璃纤维滤膜，用丙二醇的水溶液(丙二醇∶水，3∶1)洗涤2～3次。80℃烘干，即得多糖提取物。

多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸比色法(张维杰，1987)。配制0.2%的蒽酮硫酸溶液，即将0.2g蒽酮溶于100mL的95%的硫酸中。以5μg/mL的葡萄糖水溶液作为葡萄糖标准液绘制标准曲线，即分别取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL葡萄糖标准液到6支具玻璃帽的试管中，加蒸馏水至5mL，于冰水浴中缓慢加入10mL蒽酮试剂，混匀，盖上玻璃帽，于沸水浴中保温10min，取出，冷却后在分光光度计上测定625nm处的光吸收值，以葡萄糖含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。样品中多糖的测定方式与之相同。

10.藻细胞超微结构的观察

爪哇伪枝藻培养液以5 000r/min离心10min，收集藻体，用2.5%的戊二醛(0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH=7.2)固定。以0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤3次，用1%的锇酸(0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH=7.4)于4℃保存3h，用乙醇以10%的递增率逐级脱水，Epon-812环氧树脂浸透、包埋，37℃保温24h，60℃保温48h，LKB-NOVA型超薄切片机切片。在厌氧条件下，饱和醋酸铅双氧铀和柠檬酸铅双染色，以日立H-8100型透射电镜观察并拍照。

本章所有数据均重复3次以上，取平均值。

二、结果与分析

(一)UV辐射对S.javanicum生长的影响

图2-1表明，UV-A和UV-B辐射对爪哇伪枝藻生长的影响不同，UV-A促进爪哇伪枝藻的生长，而UV-B明显抑制爪哇伪枝藻的生长。经过UV辐射处理120h后，UV-A处理组的OD665值比对照组上升了17.4%;而UV-B处理组的OD665值比对照组下降了63.2%，从处理48h开始，其生长几乎呈线性下降。

图2-1　爪哇伪枝藻对UV辐射的生长响应

(二)UV辐射对S.javanicum光合活性的影响

1.UV辐射对S.javanicum叶绿素a荧光的影响

UV辐射对爪哇伪枝藻叶绿素a荧光Fv/Fm比值的影响如图2-2所示。图2-2(a)显示，4个强度的UV-A辐射对爪哇伪枝藻的影响不同。尽管两个低强度的试验组在处理24h之前，Fv/Fm比值呈下降趋势，随后又上升，但在整个实验期间对Fv/Fm比值的影响不大;2个高强度的试验组在实验期间，爪哇伪枝藻叶绿素a荧光Fv/Fm比值有很小的下降。图2-2(b)显示，在UV-B辐射下，爪哇伪枝藻的Fv/Fm比值普遍降低，特别是2个高强度的UV-B辐射，96h后，Fv/Fm比值很小，说明爪哇伪枝藻的PS II的活性很低，但藻体仍然存活，只是处于低活性状态。

2.UV-B辐射对S.javanicum光合放氧速率的影响

以光合放氧速率表示的光合作用活性，随UV-B辐射强度的增加而降低。其间，在辐射强度小于0.06mW/cm2时，爪哇伪枝藻的光合放氧速率随强度的增加而降低较缓慢;当强度超过0.06mW/cm2后，光合放氧速率呈现快速降低趋势，当强度达到0.48mW/cm2时，藻体的净光合速率(即表观光合速率，净光合速率=真正的光合速率-呼吸速率)为负值(图2-3)。

图2-2　UV辐射对爪哇伪枝藻叶绿素a荧光Fv/Fm比值的影响

(a)UV-A;(b)UV-B;辐射强度单位:mW/cm2，后同

图2-3　UV-B辐射对爪哇伪枝藻光合放氧速率的影响

(三)UV辐射对S.javanicum色素的影响

1.UV-A辐射对S.javanicum色素的影响

如图2-4所示，爪哇伪枝藻Chl a、Scytonemin和CAR含量随UV-A辐射强度的增加而增加。其中以对Scytonemin含量的影响最为明显，经过120h的辐射，1.6mW/cm2的处理组Scytonemin含量是对照组的72倍，说明UV-A辐射能诱导Scytonemin的快速合成。其次，UV-A辐射对CAR含量的影响也较为明显，辐射120h后，1.6mW/cm2的处理组CAR含量比对照组的含量增加了132%。

UV-A辐射也诱导藻蓝蛋白的合成(图2-5)，爪哇伪枝藻的藻蓝蛋白含量随UV-A辐射强度的增加而增加。但1.6mW/cm2处理组的藻蓝蛋白含量与0.8mW/cm2处理组的含量相差很小，说明UV-A辐射对爪哇伪枝藻藻蓝蛋白的影响存在饱和强度效应。

图2-4　UV-A辐射对爪哇伪枝藻Chl a、Scytonemin和CAR含量的影响

(a)Chl a;(b)Scytonemin;(c)CAR

图2-5　UV-A辐射对爪哇伪枝藻藻蓝蛋白含量的影响

2.UV-B辐射对S.javanicum色素的影响

如图2-6(a)所示，UV-B明显抑制Chl a的合成，即使只辐射24h，各处理组的Chl a含量与对照组就表现出了较为明显的差异，此时，0.48mW/cm2处理组的Chl a含量已经下降了35.6%。经过120h的UV-B辐射，最高强度处理组的Chl a含量下降到只有初始含量的23.3%，此时培养物的颜色明显变黄。图2-6(b)、(c)表明，UV-B辐射诱导保护色素Scytonemin和CAR的合成，这两种色素含量的增加能有效地减少UV-B对藻体的伤害。

经UV-B辐射后S.javanicum藻细胞中藻蓝蛋白含量明显下降(图2-7)，高强度的UV-B辐射导致的光降解作用更加显著。

(四)UV辐射对S.javanicum生化组分的影响

1.可溶性蛋白质

图2-6　UV-B辐射对爪哇伪枝藻Chl a、Scytonemin和CAR含量的影响

(a)Chl a;(b)Scytonemin;(c)CAR

如图2-8所示，UV-A和UV-B对S.javanicum蛋白质的影响也不同。经UV-A辐射，在前48h内，藻体内蛋白质含量下降，随后快速增加;在96h后，不同强度处理组的藻体中蛋白质含量都比对照组的高，如图2-8(a)所示。而UV-B处理组S.javanicum的蛋白质含量都呈快速下降趋势，且强度越高下降越快，如图2-8(b)所示，说明UV-B辐射显著破坏藻体蛋白质，使藻体蛋白质含量减少。

图2-7　UV-B辐射对爪哇伪枝藻藻蓝蛋白含量的影响

2.多糖

从图2-9(a)可以看出，UV-A辐射对爪哇伪枝藻胞外多糖的分泌和总糖的积累影响不大，不同强度处理组和对照组的EPS产量相差较小，胞内多糖的积累相对来讲差别较大;而UV-B处理组的藻体分泌到培养基中的多糖量显著增加，如图2-9(b)所示。在UV-B辐射强度为0.24mW/cm2的处理组，其胞外多糖产量最高，处理48h后，EPS产量和对照组相比增加了47.4%;0.48mW/cm2处理组的胞外多糖分泌量随时间的延长有下降的趋势，并且相对0.24mW/cm2处理组的分泌量也减少，说明低强度的UV-B辐射诱导EPS的分泌，高强度UV-B辐射可能对藻细胞造成了不可逆的伤害，使EPS的分泌受阻。胞内总糖的积累和EPS分泌量的变化趋势基本相似(图2-10)，但0.48mW/cm2处理组的胞内总糖含量仍然有微弱的增加。

图2-8　UV辐射对爪哇伪枝藻可溶性蛋白质含量的影响

(a)UV-A;(b)UV-B

(五)S.javanicum的细胞形态及超微结构观察

UV-B辐射处理组的藻浓度明显下降，颜色变黄，藻细胞沉于液体培养基中;UV-A处理组的浓度增加，藻细胞浮于液面，参见图版I。从透射电镜照片可以看出，经UV-A处理后，藻细胞内片层结构更明显，几乎充满整个细胞，脂肪颗粒和黑色颗粒数量增加，细胞外多糖颗粒增加，细胞变小;UV-B处理组藻细胞内黑色颗粒、脂肪小颗粒和多糖颗粒数量明显增加，细胞变小，参见图版II。

图2-9　UV辐射对爪哇伪枝藻胞外多糖产量的影响

图2-10　UV辐射对爪哇伪枝藻胞内总糖含量的影响