第四节 病毒的鉴定
一、病毒核酸型的测定
（一）卤化核苷酸法
当氟脱氧尿核苷（FUDR）或溴脱氧尿核苷（BUDR）或碘脱氧尿核苷（IUDR）结合到病毒的DNA中去，使其遗传性遭受破坏。它们是核酸代谢抑制剂，当其浓度达到10-5mol/L时，DNA病毒的复制就被抑制，而绝大多数RNA病毒不受影响，只有反录病毒例外，因为它们的繁殖早期需要DNA的合成。
试验方法：当细胞培养长成单层后倒掉营养液，换以含FUDR（或其他卤化核苷酸）50μg/ml的新营养液，置37℃培养过夜。倾去细胞营养液，用Hank，s液洗1次，然后接种连续10倍稀释已知病毒和待检病毒悬液，每一稀释度接种4管，于室温或37℃吸附lh后加入新营养液。含FUDR50μg/ml和不含抑制的营养液各2管。置37℃培养，每天检查细胞病变（CPE）。对不产生CPE的病毒则用其他指标检查。
结果判定：当正常营养液管的CPE已经明显，各对照管即RNA病毒对照管不被抑制，DNA病毒对照管有明显抑制，空白细胞培养生长正常时即可进行判定。含抑制剂的病毒滴度低于对照管超过2个滴度时即可判为DNA病毒，否则为RNA病毒。
注意事项：代谢抑制剂对细胞有一定毒性，在使用前要测定细胞对它的耐受力，以消除非特异性抑制效应。在维持液中不应含有胸腺嘧啶核苷（与抑制剂是同功异质体），最好用Eagle氏MEM，不要用199或1640等复杂综合营养液。试验必须设置已知RNA和DNA病毒对照和不接种病毒的空白细胞培养对照。
（二）放线菌素D（ActinomycinD）法
放线菌素D是一种多肽类抗生素，能与细胞和病毒的DNA结合，抑制依赖于DNA的RNA合成，但不抑制依赖于RNA的RNA的合成，因此它可以区分DNA和RNA两类病毒，DNA被抑制可达95%，RNA则不受影响。但有3类RNA病毒，即呼肠孤病毒、正黏病毒和反录病毒例外，它们对放线菌素D敏感。
试验方法：首先用细胞培养测定细胞对放线菌素D的耐受浓度（10、1.0、0.1μg/m1）。然后配制含测定浓度的放线菌素D的细胞营养液（放线菌素D一般为5～10μg/m1）。将待检病毒和已知对照病毒（DNA和RNA病毒）作连续10倍稀释，每一稀释度各接种4管细胞培养，置室温或37℃吸附1h。一半细胞培养管加入含放线菌素D的营养液，另一半加正常营养液。置37℃培养，每天观察CPE。
结果判定：当不含放线菌素D营养液的细胞管中CPE已经明显，RNA病毒对照管不被抑制，DNA对照管明显抑制和不接毒的细胞培养对照生长正常时即可判定结果。待检病毒被抑制超过2个滴度者即为DNA病毒。
（三）吖啶橙（acridine orange，AO）染色法
AO染色法可以测定核酸的股数。AO是一种荧光染料，在适宜条件下AO染料能与单股核酸结合，结核染料的单股核酸分子的吸收光波从原来游离染料的490nm转移到465nm，则在紫外线照射下发出红色荧光。当染料与双股核酸相遇时，结合的量甚微且容易解离，吸收光波从490nm转移到502nm而发生绿色荧光。
1.试验用溶液的配制
（1）Carnoy氏固定液：冰醋酸1份，无水酒精6份，氯仿3份。
（2）Mcllvaine氏缓冲液：0.1M枸橼酸12.9ml、0.2M Na2HPO4 7.1ml。
（3）0.01%吖啶橙染液：吖啶橙10mg溶于Mcllvaine氏缓冲液100ml中，装棕色玻瓶，冰箱贮存。
2.试验步骤 将组织触片、冰冻切片或细胞培养的盖玻片在Camoy氏液中固定5～0min。再于Mcllvaine氏液中放置5～10min。取出放于AO染液中染色5min后用Mcllvaine氏液漂洗2～3min。然后在载玻片上滴1滴Mcllvaine氏液，加盖玻片（如为盖玻片细胞培养则将细胞单层向下），用450nm光波（高压汞灯加蓝紫色泸光片）在荧光显微镜下观察。
3.结果判定：正常细胞核呈黄绿色，核仁橘黄色，细胞浆暗红色。感染细胞的核中双股DNA病毒呈黄绿色荧光小颗粒，包涵体可能呈不同形状。在细胞浆繁殖的双股DNA或双股RNA病毒在红色背景中发生黄绿色荧光，单股RNA病毒发生出鲜红色荧光。
（四）注意事项
1.用固定液固定的目的是使细胞膜的通透性增强，本试验常用的Carnoy固定液效果良好，不能用含有苦味酸或镍酸的固定液，因其可使荧光强度降低。
2.吖啶橙易与核糖体的单股RNA结合，发出红色荧光，而某些病毒的CPE常对核糖体有影响，故于检查时注意区分。
3.当AO溶液浓度超过0.05%，pH值高于6.0时，整个细胞发生红色荧光。因此AO适宜浓度为不超过0.01%，适宜的pH值为3.6～5.2。
4.在染色过程中，染色液必须新配，染色时间不能过久，漂洗液最好使用Mcllvaine氏缓冲液而不用PB。
二、病毒理化特性测定
1.热敏感性试验 有些病毒对热敏感，在50℃经30min可被灭活，但其敏感性受营养液中某些物质的浓度影响，因此在试验中的条件要一致。
方法：将病毒悬液2ml加于试管中，置50℃水浴中30min，以同样的病毒悬液置4℃30min作为对照。然后将试验组和对照组的病毒液分别作10倍连续稀释，每一稀释度接种4管细胞进行培养，滴定TCID50。加热处理的病毒悬液的感染力如比对照悬液低2.0 log以上则认为该病毒对热敏感。
2.阳离子稳定性试验 某些病毒如肠道病毒和呼肠孤病毒可被高浓度二价阳离子如MgCl2所稳定，使其在50℃60min不被灭活。也有另外一些病毒如腺病毒、疱疹病毒和痘病毒反而使其增加对热的敏感性。
方法：将病毒悬液用1.0mol/L MgCl2作10倍稀释，对照管病毒悬液用双蒸馏水作同样稀释。置50℃水浴1h。然后进行毒价滴定，比较两组的差异结果判定同热敏试验。
3.酸敏感性试验 本试验系指某些病毒（口蹄疫病毒）在pH3.0溶液中作用30min，可使其感染力降低，而对另一些病毒（猪水疱病病毒）则没有作用。
方法：取1份病毒悬液加9份pH3.0的Hank’s液；另取1份病毒悬液加9份pH7.2的Hank，s液作对照，置25℃下作用2h。作用后试验组用0.1mol/L NaOH调节其pH值至7.2。然后对试验组和对照组进行毒价滴定，比较两组的差别，结果判定与热敏试验相同。
4.胰蛋白酶敏感试验 某些病毒如肠道病毒、冠状病毒和轮状病毒等对胰蛋白酶有较强的抵抗力，而另一些病毒如疱疹病毒和痘病毒等则对胰蛋白酶敏感。
方法：首先用pH7.4的PBS将胰蛋白酶配制成1%溶液，过滤除菌。病毒悬液用3000r/min离心30min，取其上清液加等量1%胰酶溶液充分混合。另取同样的病毒悬液加等量PBS混合，处理方法与试验组相同作为对照。置37℃1h，试验组加4倍量犊牛血清，以终止胰酶的作用。然后对两组分别滴定毒价，比较两组的差异。结果判定标准与热敏试验相同。
5.病毒类脂的测定 大多数有囊膜的病毒对脂溶剂有敏感性，病毒囊膜或核衣壳上的主要类脂经脂溶剂除去后病毒即失去感染力。
（1）氯仿敏感试验：于1ml病毒悬液中加等量氯仿（AR），于另1ml病毒悬液内加等量的Hank’s液作为对照，在室温下间歇振荡10min。悬液经2000r/min离心沉淀5min，使氯仿沉于管底。吸取上层液和对照病毒液分别进行毒价滴定，比较两组差异，结果判定同热敏试验。
（2）乙醚敏感试验：取4份病毒悬液加l份乙醚充分混合，将瓶盖塞紧，置4℃冰箱内过夜。混合液经2500r/min离心20min。用移液管插到乙醚下吸取病毒悬液，滴定病毒的感染力。
（3）脱氧胆酸钠敏感试验：首先用0.75%牛血清白蛋白溶液配制0.2%脱氧胆酸钠，于4℃贮存，用前加温至37℃。病毒悬液以5000r/min离心沉淀1h。取病毒澄清液与脱氧胆酸钠溶液等量混合，同时将病毒澄清液与营养液等量混合作为对照。混合后，用pH7.0 PBS在40℃下透析24h，其间换液3次，以去除对细胞有毒的脱氧胆酸钠。通过毒价滴定，比较两组差异，结果判定同热敏试验。
注：在进行本试验时必须设立对脂溶剂敏感和不敏感的两种病毒作为对照。
三、电子显微镜检查
电子显微镜的光原是电子射线形成的电子束，随着加速电压的提高，波长进一步缩短，与普通光学显微镜用的可见光的波长相比，缩短了数万至数十万倍，即把物体放大数十万倍，再加上光学放大，则可达数百万倍。因此电子显微镜技术为研究细胞和各种微生物特别是病毒的超微结构和形态提供了有利的工具。
这里仅就超薄切片技术和复染方法作一概要介绍。
（一）超薄切片技术
超薄切片主要用于电镜下观察感染细胞内的病毒形态和存在部位。超薄切片的厚度只有0.01～0.1μm，需用特殊专用的切片机才能制备。超薄切片的制备程序基本包括如下五个方面。
1.标本样品的采集和固定：样品必须采自活体，从采集到固定应在2～3min内完成，最长不可超过5min。死亡动物的组织绝对不能应用，因为死后细胞内各种酶的活动导致细胞自溶，使细胞的结构遭受破坏。固定前将样品剪成小于1mm3的小块，投入2.5%戊二醛溶液中初步固定0.5～2h，随即用PBS充分冲洗；再投入1%四氧化锇液中约1h作进一步固定，之后再用PBS充分冲洗。
2.脱水 常用的脱水剂为丙酮和乙醇。脱水时需从低浓度到高浓度，逐步过渡。通常由50%浓度的水溶液开始，逐级经70%、90%、100%和100%五次脱水，每次15min。
3.包埋 包括样品的包埋剂浸透和聚合两道程序。常用的包埋剂主要有环氧树脂、聚酯树脂和甲基丙烯酸酯三大类，其中以环氧树脂为好。包埋时通常先把样品投入脱水剂和包埋剂1：1混合液中过渡一次，然后再用纯包埋剂置换；也可将样品直接投入包埋剂中30～60min。包埋剂的浸透必须完全。聚合是使已浸透包埋剂的样品固化，通常将样品放于60℃～ 70℃干烤箱中24～48h，即可完成固化过程。
4.切片 在进行切片前需准备好直径2～3mm，网目200～300个的载网（多系铜网）。制膜（载体）常用0.2%～0.3%聚乙烯醇缩甲醛的三氯甲烷溶液，配制后贮于冰箱备用。修整固化的组织块，修整成梯形、正方形或长方形，边长约0.1mm，顶、底两边必须平行，以便形成连续切片带。将修整好的标本块夹在标本夹上，于特殊专用切片机上进行切片。收集切片时，应注意在荧光灯照射下因不同厚度的切片形成不同的干涉色：暗灰色为400nm以下，灰色为400～500nm，银色为500～700nm，金黄色为700～900nm，紫色为900nm以上。超过700nm的切片太厚不易观察。通常选500nm以下的切片制成供透射电镜检查的切片。为此用细玻璃针根据切片的干涉色把500nm以下的拨在一起，把500nm以上的切片挑掉。然后用带有聚乙烯醇缩甲醛膜一面的铜网，在水槽上蘸取切片，以将铜网插入水槽后向上提的方法使切片贴于膜上。
5.染色 切片制备好后即可进行染色，一般常用1%～3%饱和醋酸铀的50%～70%乙醇或丙酮溶液，也可与柠檬酸铅染液配合使用做双染色。
（二）二复染技术
复染又称阴性反差染色。此法快速、简单，用于检测细胞外游离的病毒，特别适用于难于培养的病毒。复染标本的电镜检查，当今在医学和兽医学临诊上，对某些形态特征明显的病毒如疱疹病毒、轮状病毒、冠状病毒、痘病毒和细小病毒等所致的传染病，结合临床症状和流行病学资料，常常可以作出快速初步诊断或确诊，从而拓宽了电镜应用范围。但由于应用此法检测的样品中病毒浓度必须不低于107/ml时，才能获得阳性结果，因而它的使用还是受到一定的限制。
复染溶液通常用2%磷钨酸钠水溶液，以1mol/L KOH液调整pH值至6.8～7.0。滤过除菌后密封保存于4℃可长期使用。
待检样品要尽可能纯净，最好是先经初步纯化的病毒悬液。如粪便或组织块可加适量缓冲液制成匀浆，以3000r/min离心沉淀30min，去除杂质后用上清液制片。水疱液、气管洗涤液和脑脊液等，同样经上述离心沉淀后用上清液制片。感染的细胞培养物先经反复冻融3次，使病毒粒子释出，用上法同样离心后用上清液制片。在检查能抵抗有机溶剂的病毒（如细小病毒、轮状病毒）患畜的粪便时，为了提高检出率，可按粪便1∶1容量加入氯仿或乙醚，充分振荡10min，再按上述离心沉淀20min，取水相上清液制片。为了提高病毒浓度，增加检出机会可将上述制片用的上清液作超速离心的沉淀后，弃上清，将沉淀悬浮于少量缓冲液后制片镜检。
复染色分悬滴法和喷雾法两种，仅介绍操作简便而又常用的悬滴法。用毛细管吸取少量待检病毒悬液，滴加在有支持膜的铜网上，使附着在表面上的悬液呈半球形，静置2～3min后，用滤纸从一侧网边吸去多余的液体。稍干后取一支毛细管吸1滴2%磷钨酸染液滴在网上，染色0.5～1min，再用滤纸吸去染液后，立即做电镜观察。
（三）病毒的电镜凝集试验
本试验属于免疫技术与电镜技术相结合的免疫电镜技术之一。它的原理与细菌凝集试验的相同，只是借助电镜的高倍扩大，使与相应抗体作用下发生凝集的病毒粒子成为电镜下可见的抗原—抗体复合物（凝集物）。由于方法简单易行，结果确实可靠，因而这项技术近年来已发展成为常规的检验手段，它不仅可用于某些病毒性疾病的诊断，而且还可用于病毒的分型鉴定。病毒电镜凝集试验用的病毒悬液，主要是病毒细胞培养液，也可直接用临床病料，如含有大量病毒的粪便或组织等，但都必须先作适当纯化和浓缩。悬液中的病毒纯度和浓度，直接关系到试验结果。有关细胞培养病毒悬液的处理，可参看复染技术。
将超速离心沉淀的病毒悬于适量的生理盐水中，取1滴病毒悬液和适当稀血的抗血清1滴相混合，放4℃过夜，次日即可按上述方法进行复染和电镜检查。凝集反应阳性，可见到病毒粒子凝集成团，但由于病毒间存在抗体分子，使病毒粒子之间有一定距离。
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