原生质体双灭活技术选育埃博霉素高产菌株的研究

原生质体双灭活技术选育埃博霉素高产菌株的研究⁽¹⁾

陆一鸣　罗立新　潘　力

（华南理工大学生物科学与工程学院　广州　510640）

摘要：纤维堆囊菌产生的次级代谢产物埃博霉素是受医学界广泛关注的抗癌良药，由于其较低的产量阻碍了其工业化的发展，本文采用纤维堆囊菌DSM11999作为出发菌株，通过紫外诱变和原生质体双灭活融合的双重方法来筛选优良菌种，最终使埃博霉素的产量提高了37.8 %。

关键词：纤维堆囊菌；诱变；原生质体双灭活融合；育种

粘细菌（Myxobacteria）是一类高等的原核生物，它具有复杂的多细胞行为，是革兰氏阴性细菌，能够产生丰富的生物活性次级代谢产物，而且产物生物活性作用的多样性可以与著名的链霉菌类群相比拟^[1]。

纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）属于粘细菌的溶纤维素类群，它产生的大环类酯类化合物埃博霉素（Epothilone）具有促微管聚合的活性，是目前引起医药界广泛关注的抗癌物质。埃博霉素能与真核细胞中的微管骨架结合，导致染色体分离受阻，细胞核不能分裂，作用的有效浓度为10～20 ng/ml。埃博霉素的作用机制与著名的抗癌药物紫杉醇相同，但是其来源简单不受限制，毒性更小^[2]。虽然目前有很多种化学法可以合成埃博霉素，但是具有反应条件苛刻，成本高，合成路线长以及产率低等缺点^[3]，而且会对环境造成污染，不是绿色的化学反应，而工业发酵制备合成埃博霉素则可以克服上述缺点。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　菌株

纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum） DSM11999菌株购于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ，Braunschweig，Germany）

1.1.2　培养基

S42培养基：胰蛋白胨0.5 g/L，MgSO₄· 7H₂O 1.5 g/L，HEPES 12 g/L，（NH₄）₂SO₄0.5 g/L，CaCl₂· 2H₂O 1g/L，K₂HPO₄0.06 g/L，葡萄糖3.5 g/L，EDTA铁钠0.008 g/L，Agar15 g/L，用KOH调pH至7.4，0.1 MPa灭菌20 mins。

种子培养基（G52培养基） ：干酵母粉2 g/L，MgSO₄· 7H₂O 1g/L，CaCl₂· 2H₂O 1g/L，脱脂奶粉2g/L，马铃薯淀粉8g/L，无水葡萄糖2 g/L，EDTA铁钠8g/L，用KOH调pH至7.4，0.1MPa灭菌20mins。

发酵培养基（1B12培养基） ：马铃薯淀粉20 g/L，脱脂奶粉11g/L，EDTA铁钠8mg/L，用KOH调pH至7.8，0.1MPa灭菌20mins。

VY/2培养基：干酵母粉5 g/L，CaCl₂· 2H₂O 1g/L，V_B120.5 mg/L，Agar 15 g/L，用KOH调节pH至7.2。

SMM溶液： 0.05mol/L蔗糖、2mmol/L顺丁烯二酸、2mmol/LMgCl2，用NaOH调pH至6.5。

1.1.3　Tris-HCl溶液

1.211g/LTris，用HCl调pH至8.0

1.1.4　Tris-HCl高渗溶液

1.211g/LTris、171.15 g/L蔗糖，用HCl调pH至8.0

1.1.5　高渗蔗糖溶液

0.6 mol/L蔗糖

1.2　方法

1.2.1　菌种的诱变

取保存于斜面的菌种1～2环接种于种子培养基中，于30℃，180 r/min摇瓶培养3 d，摇匀后，取5ml菌液于9cm平皿中，加入转子，置于紫外灯下10cm处照射，照射前紫外灯应该提前30min打开以稳定光波。然后做适当10倍稀释涂高渗平板，30℃暗培养，计算致死率。照射不同的时间之后在暗处30℃培养2～3 d^[4]。

1.2.2正突变优势菌株的筛选

无菌操作取直径为1～2 mm的单菌落接种于G52液体培养基，30℃、180r/min振荡培养3 d后，再接于1B12培养基中发酵培养6 d，最后取发酵液离心16000 r/min、7 mins取上清液通过高效液相色谱检测产物峰。

色谱条件为^[5]：色谱柱： Scienhome C18，Zirchrom Kromasil ODS-1，200×4.6 mm

　　　　　　　　柱温：30℃

　　　　　　　　检测：250nm，UV-DA Ddetestion

　　　　　　　　流动相：0～7min　　　　41%B

　　　　　　　　　　　　7.2～7.8min　　100%B

　　　　　　　　　　　　8～12min　　　 41%B

　　　　　　　　A：0.02%磷酸水溶液，B：乙腈

1.2.3　原生质体融合

1.2.3.1　原生质体的制备：取处于对数生长前期的菌液，4℃，5000 r/min离心收集菌体，用

0.1 mol/L的Tris-HCL （pH8.0）洗涤三次，然后将菌体悬浮于含有0.5 mol/L蔗糖的0.01mol/L的Tris-HCL （pH8.0）中，并在20 mins内缓慢加入EDTA （0.1 mol/L，pH 8.0）至其终浓度为0.01 mol/L。然后将细胞于37℃，100 r/min振荡20 mins，以除去外层细胞膜，再收集细胞，用SMM缓冲液洗涤两次，最后加入适量溶菌酶于37℃，100 r/min进行酶解，悬浮于高渗蔗糖溶液中备用^[6，7]。

1.2.3.2　酶浓度的确定：取50000U/mg的溶菌酶的酶浓度分别为0.5 mg/ml，1.0 mg/ml，1.5 mg/ml，2.0 mg/ml进行酶解，观察原生质体的制备率和再生率。

1.2.3.3　酶解时间的确定：酶解时间分别取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h，观察原生质体的制备率和再生率。

1.2.3.4　原生质体双灭活：由于没有原生质体融合子的筛选标记，我们选择双灭活融合法。将制备好的原生质体进行双灭活处理，既紫外灭活和热灭活，分别将装有菌液的试管放在热水中处理20min，已经在紫外灯下照射一定的时间。

1.2.3.5　原生质体电融合：将灭活的6种菌的原生质体悬浮于0.6 mol/L的蔗糖溶液中，等量混合后置于0.4 cm的电转杯中，分别用方波和指数衰减波进行电融合，方波采用3000 V，50μs，间隔5 s，电击2次，而指数衰减波采用的条件是3000 V，200 Ω，25 μF，间隔10 s，电击2次^[8，9，10]，然后涂VY/2平板，培养2d之后挑取直径为1 cm左右的菌落接种发酵，进行HPLC以观察结果。

2　结果和分析

2.1　紫外诱变

2.1.1　种子液稀释倍数的确定

把不同稀释倍数的种子液50μl涂布S42培养基平板，培养48h后对菌落计数，发现当稀释倍数为100～105，菌落个数太多，菌悬液中细胞团太多，还未形成单细胞状态，而稀释倍数10⁷时菌落个数太少，减少出现高产突变株的几率，由此可确定种子液的稀释倍数为10⁶。实验结果见表1。

2.1.2　致死率和UV剂量的确定

将未用UV处理的菌悬液所涂的平板与用UV处理不同时间的菌悬液分别稀释10⁵倍后涂S42培养基平板，培养48h后进行菌落记数，按照下式计算^[4]：

死亡率= （未用UV处理的菌落数-用UV处理的菌落数） /未用UV处理的菌落数计算致死率，实验结果见表1。

表1　菌悬液菌落计数

为得到满意的诱变结果，我们选择致死率约为90%的照射剂，即照射时间5min，种子液的稀释度为106倍，照射距离10cm作为诱变条件。

2.1.3　正突变优势菌株的筛选

诱变之后挑取了14个菌进行发酵，HPLC检测结果与原种的比较见图1。

由图1可得出UV1、UV3、UV5、UV6、UV7和UV8的色谱峰相对于原种有不同程度的提高，其中最高的是UV5，产量提高了4.8%，于是选择这六株菌作为原生质体双灭活融合的出发菌株。

表2　用UV照射不同时间的菌落数及致死率

图1　突变种与原种的色谱峰高比较

2.2　原生质体融合

2.2.1　最适酶浓度

取50000U/mg的溶菌酶的酶浓度分别为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml进行酶解，制备原生质体，稀释至10⁷涂平板，分别计算酶解前平板菌落数（A） ，酶解后平板菌落数（B）和用蒸馏水稀释后的平板菌落数（C） ，并按照下式计算^[4]：

制备率＝（A-C） /C，再生率＝（B-C） / （A-C） ，见表3。

从表3可以看出，随着溶菌酶用量增加，原生质体的形成率也增大，但是超过一定浓度，原生质体形成率就不会再明显提高。溶菌酶用量过低，则不利于原生质体的形成；溶菌酶用量过高，则导致原生质体再生率降低。为了使原生质体的形成率不会太低，又有一定的再生能力^[11]。一般采用使原生质体形成率与再生率之乘积达到最大时的酶量作为最佳溶菌酶用量^[12]，故选择最适酶浓度为1.0 mg/ml。

表3　原生质体的制备和再生结果

2.2.2　最适酶解时间

取50000U/mg的溶菌酶的酶浓度分别为0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0h、2.5 h进行酶解，制备原生质体，稀释至10⁶涂平板，分别计算酶解前平板菌落数，酶解后平板菌落数和用蒸馏水稀释后的平板菌落数，并计算制备率，再生率以及它们的乘积，见表4。由于当制备率与再生率的乘积最大时的条件是最佳的^[11]，故选择最适酶解时间为1 h。

表4　原生质体的制备和再生结果

2.2.3　原生质体灭活条件

对紫外灭活和热灭活，分别取了一系列的灭活条件。结果如下图2、图3显示。分别在离紫外灯10cm处照射1、2、3、4、5、10、20、25min后，稀释至10⁶涂于VY/2高渗平板，计算出紫外灭活后平板上的菌落数（D） ，按照下式计算^[13]：

紫外灭活率＝1-D/ （B-C）

另外分别在55℃、65℃、75℃、85℃水浴15min后，稀释至10⁶涂于VY/2高渗平板，计算出热灭活后平板上的菌落数（E） ，按照下式计算^[13]：

热灭活率＝1-E/ （B-C）

从图中我们可以看出原生质体的紫外灭活时间比没有制备原生质体的时候要长一些，这应该是由于原生质体在高渗溶液中受到了一定的保护作用，因此使得紫外照射的时间增加了。

图2　原生质体紫外灭活率

图3　原生质热致死率

由图2、图3的数据显示，我们选择在离紫外灯10cm处照射25min，以及在水浴85℃的条件下处理15min以达到原生质体双灭活的目的。

2.2.4　原生质体电融合

取最适酶浓度1.0 mg/ml和最适酶解时间1 h制备原生质体，将制备好的六株菌的原生质体进行分组，每组三株，分别进行热灭活和紫外灭活。灭活后的亲本原生质体每组各取60μl，进行电融合，将融合后的菌液稀释至10⁶涂于VY/2高渗平板，计算平板上的菌落数（F） ，并按下式计算原生质体的融合率^[13]。融合的结果见表5。

表5　原生质体融合综合数据

值得注意的是此菌在含蔗糖的VY/2平板上生长的菌落呈透明黏液状，菌落表面光滑湿润，而在不含蔗糖的VY/2平板上菌落呈乳白色，菌落表面有褶皱，菌落周围呈锯齿状，如图4所示为在含蔗糖的VY/2平板和不含蔗糖的VY/2平板上的菌落形态对比。

图4　纤维堆囊菌原生质体融合后的菌落形态

挑取平板上直径为1～2 cm的菌落进行发酵，一共挑取了15个菌，发酵液的色谱峰结果如图5所示。

由图可见R1、R2、R5、R6、R7的峰高较出发菌株有不同程度的提高，而且比紫外诱变后的菌株提高的程度大很多，相对于原来的菌株产率分别提高了37.8%、20.6%、22.5%、21.6%和25.1%。

3　结论和展望

上述实验表明，通过紫外线诱变和原生质体融合双重育种的方法可以有效地提高纤维堆囊菌产埃博霉素的产量。将菌液稀释至10^-5涂S42平板，经紫外照射10 min后，得到正突变的菌株可以使产量提高4.8%，再经过原生质体融合进一步育种筛选，可得到使产量提高37.8%的优良菌株，达到预期的目的。

由于以前还未见有关于粘细菌制备原生质体的报道，而粘细菌属于革兰氏阴性菌，于是本实验参照大肠杆菌等革兰氏阴性菌的原生质体的制备方法，以及结合电穿孔仪的性能参数设计了本次原生质体制备和融合的实验，这方面的研究不免还有很多可以改善之处，以后可以加强这方面的探讨和研究，进一步改善实验的操作条件从而得到性能更优良更稳定的菌株。另外还可以进行多轮的融合筛选，使得优秀的性状得以积累，以达到筛选高产菌株的目的。

参考文献：

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[13]周海霞.灭活原生质体融合选育α-ALDC高产菌株.河北大学理学硕士学位论文，2004

【注释】

(1)广东省自然科学基金资助项目（131357）