青霉素发酵生产技术

技能训练　青霉素发酵生产技术

一、能力目标

掌握青霉素的发酵生产及发酵过程控制。

二、相关知识

1．青霉素生产菌的生物学特性

青霉素生产菌形成绿色孢子和黄色孢子的两种产黄青霉菌株；深层培养中菌丝形态为球状和丝状两种，我国生产上采用的是丝状。

菌落：平坦或皱褶，圆形，边沿整齐或呈锯齿状或扇形。气生菌丝形成大小梗，上生分生孢子，排列呈链状，似毛笔，称为青霉穗。孢子呈黄绿至棕灰色，为圆形或圆柱形。

2．发酵条件下的生长过程

第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。

第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。

第3期：形成脂肪包涵体，没有空泡，嗜碱性很强。

第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。

第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。

第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然呈桶状，释放游离氨，pH上升。

第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。

镜检：规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。

1～4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。

4～5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。

在第6期到来之前结束发酵。

3．青霉素的临床应用

青霉素临床上主要用于革兰氏阳性球菌，例如链球菌、肺炎球菌、敏感的葡萄球菌等的感染。青霉素不耐酸，胃酸能导致β－丙酰胺环裂环失去活性，口服无效，需注射给药。青霉素具有酸性，不溶于水，可溶于有机溶剂。临床以其钾盐或钠盐供药用，称为青霉素钠、青霉素钾。青霉素的钠盐或钾盐均易溶于水，但是水溶液在室温下不稳定，易被水解失效，因此注射用青霉素为其钠盐或钾盐的灭菌粉末。青霉素粉在制备时要符合相应的要求，如粉末无异物，配成溶液或混悬液的澄明度要合格；粉末的细度或结晶应适宜，便于分装；制备要求无菌、无热源。

三、实训材料

1．设备

药物粉末分装机、轧盖机等。

2．材料

青霉素钠、青霉素钾、西林瓶（10mL）、胶塞、铝盖。

四、操作要点

1．青霉素的发酵

（1）种子培养基

玉米浆4．0%（以干物质计），蔗糖2．4%，硫酸铵0．4%，碳酸钙0．4%；pH6．2～6．5。

（2）发酵培养基

玉米浆3．8%（以干物质计），磷酸二氢钾0．54%，无水硫酸钠0．54%，碳酸钙0．07%，硫酸亚铁0．018%，硫酸锰0．0025%；pH4．7～4．9。

（3）种子培养

将产黄青霉（型号99－8）接入灭菌降温至25℃的种子培养基进行培养，培养温度为25℃，搅拌速度为110r／min，空气流量为0．5～0．9m³／（m³种子液·min），培养至对数生长后期。

（4）发酵期间主要控制参数

接种量为15%，温度为25℃，罐压为0．04～0．06MPa，搅拌转速为120r／min，空气流量为0．5～0．7m³／（m³发酵液·min）。当发酵液中氨氮含量下降至450μg／mL以下时，开始补加硫酸铵。在后续发酵过程中控制发酵液氨氮含量为300～500μg／mL，并在线监控溶解氧（DO）和pH，100m³的发酵罐搅拌功率为200～300kW，罐压控制在0．04～0．05MPa，于25～26℃下培养，发酵周期为200h左右。前60h，pH为5．7～6．3，温度为26℃；后期pH为6．3～6．6，温度为24℃。溶解氧若小于30%饱和度，产率将急剧下降；溶解氧若低于10%饱和度，则造成不可逆的损害。所以不能低于30%饱和溶解氧浓度。

青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓度、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后pH波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。

2．青霉素的提炼

青霉素的提炼分为预处理、过滤、萃取、脱色、结晶等步骤，具体工艺流程及操作步骤可参见前文。