灵长类动物的转基因研究及其引发的伦理问题

2001年1月《科学》（Science）杂志报道，沙滕（G.Schatten）领导的研究小组在美国俄勒冈州的灵长类研究中心成功地应用转基因技术，将源自水母的绿色荧光蛋白（GFP）基因导入猕猴[Macaca mulatta（rhesus monkey）]的生殖系基因组，获得了第一批灵长类转基因动物。

沙滕研究组将携有GFP基因的逆病毒载体包裹在水疱病病毒的糖蛋白外壳内，注入224枚成熟的猕猴卵母细胞的卵周间隙。体外培养6h后，用卵细胞浆内精子注射术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）进行人工授精，其中有40枚受精卵发育到了早期胚胎阶段。待受精卵分裂两次后，将40个四细胞期的胚胎以两个一组的方式移入代孕母猴的子宫任其继续发育，最后产下3只健康的小猕猴和两对流产雄性双胞胎。经13种组织细胞的系列分子生物学检测，证明其中有一只雄性小猕猴所有被检细胞都插入了GFP基因，并转录出了相应的RNA，其中包括睾丸细胞，这表明GFP基因已整合于该猕猴的生殖系基因组。研究人员就以“插入的DNA”的英文“inserted DNA”的反向缩写ANDi来命名这只小猕猴，中文名爱迪。尽管爱迪的外观并没有显示出GFP基因表达的绿色荧光蛋白，但是相应的死亡胎猴的毛发和趾甲都因绿色荧光蛋白的存在而闪着绿色，死胎胎盘的免疫检测和强荧光染色都证实了转基因GFP的表达（图9-11）。此后，威斯康星大学医学院的戈罗斯（T.G.Golos）研究小组用不完全相同的转基因技术也实现了猕猴的GFP转基因实验。

图9-11　绿色荧光蛋白（GFP）转基因猕猴实验（引自A.W.Chan等）

（a）携有插入的绿色荧光蛋白（GFP）DNA的转基因猕猴爱迪（ANDi）；（ b）和（c）分别显示雄性死胎的毛发和趾甲中GFP基因表达的绿色荧光蛋白，但在爱迪外观可及的相应组织没有显示。雄性死胎胎盘冰冻切片的免疫染色和强荧光（hyper fluorescence）检测均证实绿色荧光蛋白的存在；（d）显示用免疫荧光显微镜检测红色若丹明（rhodamine）染色的GFP抗体（anti-GFP）检测结果；（e）显示用Hoechst 33342染色的强绿色荧光直接检测到同一切片的转基因表达；（f）绿色和红色显示图像的相互重叠表明了显示GFP的直接荧光与显示GFP抗体的红色的共定位

2009年，日本庆应义塾大学的冈野英之（H.Okano）与中央实验动物研究所的埃里卡佐佐木（E.Sasaki）合作，用病毒载体将外源基因GFP转入普通狨猴（Callithrixjacchus）胚胎，再植入代孕狨猴的子宫。4个代孕狨猴共产下5个子猴，经鉴定全部为转基因狨猴。其中有两个狨猴的转基因被证实已经整合于生殖系，并从两个狨猴中的一个获得第二代的GFP转基因狨猴。这是外源转基因在世界上首次被传递到下一代灵长类动物并得到表达的实验。鉴于普通狨猴是体型最小的一种灵长类哺乳动物，在功能和解剖上比啮齿类动物更类似于人，预期在开发和研究人疾病的动物模型方面将会有更重要的应用前景。

图9-12　冈野英之等共获得5个表达GFP转基因的普通狨猴子代，在紫外线照射下观察，可见它们的脚部都呈现绿色荧光（引自E.Sasaki等）

如前所述，遗传工程小鼠已经在基因功能及其调控机制的诠释、疾病动物模型的构建和基因治疗实验研究等方面为我们提供了极有价值的资料。可是，小鼠毕竟是啮齿类哺乳动物，而人类则属灵长类，在小鼠和人类之间，能有一种可利用转基因技术进行基因组修饰的灵长类动物模型，对于阐明人类生物学中的特殊问题，如早期胚胎发育及发育过程中母体与胎儿间的相互作用，还有只有灵长类动物有类似人类的月经周期、衰老和退行性病变等机制，以及高级神经活动等，工程化修饰的灵长类动物模型无疑是非常有价值的。长期以来，猕猴在医学研究中一直占据着重要的位置，例如与输血密切相关的Rh因子发现，艾滋病、肺结核和疟疾等传染病疫苗的临床前实验，以及放射生物学、神经生物学和行为生物学研究，都是以猕猴为非人灵长类实验动物的。人类和灵长类动物除了在疾病（特别是神经系统疾病）的发病机制、治疗途径、药物反应等方面有更多的相似之处外，还在行为的复杂性和群体社会结构方面也有很多的相似性。2007年4月，《科学》（Science）杂志发表了猕猴的基因组序列，为更加精确的非人灵长类基因组的结构修饰加快实验进程创造了条件。灵长类动物转基因实验的成功使得利用比啮齿类动物更接近人的灵长类动物构建疾病模型成为可能。

亨廷顿病（Huntington disease，HD）是一种常染色体显性的神经退行性疾病，其症状包括运动神经受损、认知能力衰退和精神紊乱，往往在发病后10～15年内死亡。亨廷顿病的相关基因是位于4号染色体4p 16.3的亨廷顿蛋白（huntingtin，HTT）编码基因，其致病原因是该基因第一外显子中编码谷氮酰胺的胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸重复（CAG）扩展，造成在脑和周围神经组织，特别是大脑皮层和纹状体中广泛表达的突变型蛋白HTT中多聚谷氨酰胺（polyQ）的扩展。尽管早已用啮齿类动物建立了HD模型，但是并没有呈现出HD患者典型的脑部病变和行为特征。然而，人和高等灵长类动物在遗传学、解剖学、生理学，特别是神经生物学等方面的高度相似，使猕猴成为研究人体的正常生理和疾病的非常有用的动物模型。2008年，美国埃默里大学（Emory University）的杨（S.H.Yang）等成功构建了能表达携带PolyQ的HTT的恒河猴HD模型。他们在转基因猴的脑中观察到了细胞核内包涵体和神经纤维聚集等HD患者典型的解剖学特征，以及变应性肌张力障碍和舞蹈病等主要的HD临床症状。这个转基因猴HD模型将会帮助我们更好地了解HD的致病机制和寻找更有效的治疗途径，也为建立其他遗传病的非人灵长类模型提供了有价值的经验。

2014年，牛昱宇（Y.Niu）和季维智（W.Ji）等中国科学家应用能介导特定DNA序列定点修饰和编辑的CRISPR/Cas系统，对长尾猕猴（Macaca fascicularis）基因组进行了工程化修饰，所获得的子猴表明在灵长类动物进行基因组特定序列的定向编辑是可行的。CRISPR/Cas介导的DNA定点编辑系统曾经被用于体外培养的哺乳动物和人细胞，也曾经用于构建小鼠、大鼠和斑马鱼基因修饰动物。但用于灵长类特定基因的靶向修饰动物的构建尚属首次。中国科学家将引导基因组编辑的RNA注入长尾猕猴的单细胞期胚胎，成功地修饰了三个基因：调节代谢的基因、调节免疫细胞发育的基因和调节干细胞与性别决定的基因。通过DNA定点编辑系统成功构建基因组经过修饰的猕猴表明，构建遗传学上修饰的人也不是不可能的。事实上CRISPR/Cas系统已经修饰过体外培养的人体细胞，只是还没有在人的胚胎或成人试验过。牛昱宇等的工作给这种技术应用于人类提供了更多的现实可能性。例如，这种技术将来也可能会应用于人类遗传病的基因治疗。然而，除了一般的动物福利以外，灵长类动物的遗传工程修饰必须考虑伦理相关的一系列问题，因为人也是灵长类动物的一员。有关灵长类实验研究的时代也许刚刚翻开了第一页。这项工作的简要介绍如图9-13。

图9-13　利用CRISPR/Cas9诱变系统获得定点突变的猕猴实验程序示意（改自S.Yong）

实验通过人工授精获得单细胞期胚胎，然后注入特定的DNA内切酶Cas9的mRNA和指导定点修饰的单链向导RNA（single-guide RNA，sgRNA），经短期培养后植入代孕母猴的子宫，待妊娠期完成后即可产下特定基因序列得到预期修饰的突变型子猴（CRISPR系成簇且带有规律间隔的短回文重复序列的英文clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences缩写，Cas9系CRISPR关联基因的英文CRISPR-associatedgene缩写）。

然而，从爱迪开始的一系列研究提出的问题远远多于这些研究所解决的问题。最突出的是爱迪很快被某些学者认为是设计人类婴儿的第一步。当然，现在离有能力进行人类自身的设计可能还非常遥远，但灵长类动物生殖系基因组的遗传操作确实是迈向这个方向的重要一步。主持爱迪研究工作的沙滕说：“我们不鼓励将工作延伸到人的研究。”然而，许多医学生物学家和临床医生认为再过10年，或更长一些时间，生殖系的基因治疗的安全性问题将会随着基础和应用基础研究的深入而得到解决，到那时候，生殖系基因治疗很可能会纳入临床医学范畴。或者说以疾病治疗为目的的“转基因人”迟早会诞生。实际上，我们对基因治疗的伦理思考远不止于安全性问题。现在已经有人想借生殖系基因组修饰让生下的孩子眼睛更大一些，鼻子更挺一些，肌肉更发达一些，头脑更灵活一些，免疫力更强一些……这些为了改变自己家庭传承的遗传结构和生命特征而进行生殖系基因组遗传操作的所谓遗传改良（genetic improvement），已远远超出了遗传病的基因治疗的医学目的，并会危及人类基因组的完整性和多样性，也会在生命物质最基础的层次上挑战人的尊严。直至今天，人们还无法接受对自身遗传物质可遗传的人为改造，也难以承受由此可能带来的意想不到的灾难性后果。总而言之，我们在开发转基因及其相关技术在医学生物学领域中的应用项目时，必须慎思技术的每一次进步可能带来的更深层次的伦理问题。我们还不能对未来世代做出任何有说服力的技术或伦理与法律承诺。