最新研究进展

（一）bHLH转录因子

哺乳动物内耳的形态生成和毛细胞的产生是由局部的细胞间相互影响及特异的基因调控的，其中最关键的就是bHLH基因转录调控因子，比如果蝇atonal人类同源基因1 （mammalian atonal　homolog　1，Math1）是毛细胞分化的正向调控因子，而Hes1和Hes5则充当着负性调节的作用。

Math1是一种果蝇atonal的鼠类同源基因，已证实是一种原毛细胞基因，从多能祖细胞分化成毛细胞需要Math1的参与，它对于毛细胞分化是必需的。发育中的毛细胞表达Math1，而非感觉细胞不表达。Math1基因敲除鼠无法形成毛细胞。新生鼠内耳组织培养物过表达Math1会引起GER区域额外毛细胞的产生，而Hes1基因的敲除也会引起GER区域异位毛细胞的产生，并且这些毛细胞显示有Math1表达水平的升高。通过腺病毒载体转染Math1基因至成熟豚鼠耳蜗的内淋巴囊从而构建Math1在耳蜗非感觉细胞的过表达模型，结果显示Corti器、内沟细胞以及Hense细胞区域产生了不成熟毛细胞，并且听觉神经轴突伸向一部分的新生毛细胞，这提示新生毛细胞吸引了听觉神经元。因此，成熟耳蜗的非感觉细胞有形成新生毛细胞的能力，同时，Math1足以诱导非感觉细胞分化成毛细胞。

最近又有学者利用腺病毒载体将Math1基因导入成熟的致聋内耳非感觉细胞，诱导了毛细胞的再生，并且基本上改善了听阈。这是首次在成年致聋哺乳动物的Corti器中实现毛细胞结构和功能的恢复。实验结果表明：表达促生长的关键基因可以使受损听觉上皮以及其他感觉系统的细胞实现功能的修复。另外，bHLH家族成员Hes1和Hes5也被证实共同参与内耳毛细胞分化的负向调控，并且可能是通过拮抗Math1的正性调节作用而起负向调控作用。

原位杂交揭示在GER和小上皮嵴（lesser epithelial　ridge，LER）区域Hes1有广泛表达，而Corti器（毛细胞和支持细胞）缺乏表达，在除GER和LER之外的耳蜗底圈的支持细胞有很微弱的Hes1表达；Hes5主要在LER及Corti器支持细胞（Pillar细胞和Deiters细胞）中表达，而在GER中的表达仅限于一条窄带内的细胞，在毛细胞中同样不表达。在前庭器官支持细胞中可见强Hes5表达，但与Hes1不同，Hes1在感觉上皮的所有支持细胞中表达，而Hes5在微纹区的支持细胞中表达水平很高，在非微纹区Hes5的表达水平则相对很低。Hes1和Hes5于胚胎14d开始表达，出生后表达甚微。Hes1基因敲除鼠中，耳蜗内毛细胞数量明显增加；Hes5基因敲除鼠中，耳蜗外毛细胞和前庭毛细胞数目有显著增加，提示Hes1主要参与内毛细胞数目的准确调控，而Hes5则主要对外毛细胞的产生具有重要意义。另外，有研究证实bHLH转录因子是Notch信号系统的靶基因或拮抗分子。当Notch激活时，不同bHLH转录因子或被激活或被抑制。Notch激活后诱导Hes1、Hes5表达，故Hes1及Hes5是Notch信号通路的下游靶基因。作为毛细胞负性调控基因，Hes1/Hes5激活后，拮抗毛细胞分化的主要正性调控基因Math1的作用。

就目前的研究成果看，毛细胞分化的正性调控基因Math1和负性调控基因Hes1及Hes5之间的平衡对内耳正常数目毛细胞的产生尤为重要。也许可以通过上调Math1和（或）下调Hes1/Hes5的水平来诱导毛细胞的再生。

（二）干细胞

根据细胞生物学定义，干细胞必须具有很强大的自我更新及分化成各种细胞类型的能力。大部分学者认为哺乳动物感觉上皮的支持细胞即是干细胞。关于非哺乳类动物的研究表明，靠近损伤毛细胞的支持细胞可以重返有丝分裂，并且通过对称或不对称的分化而转变成毛细胞。也有实验证明，损伤后的两栖类哺乳动物的感觉上皮具有自我修复的能力，毛细胞从周围支持细胞的转分化是通过非有丝分裂机制实现的。成年小鼠椭圆囊感觉上皮细胞经分离培养，会产生具有增殖能力的细胞球，它们具有自我更新的能力，同时也可以产生一种细胞类型，该细胞同时对毛细胞标记物（如myosinⅦa及Brn3．1）和支持细胞标记物（p27Kip1）呈阳性反应。基于以上证据，支持细胞可以被看做是干细胞。

虽然支持细胞的转分化可以看做是替代损伤毛细胞的一种比较简单的途径，但感觉上皮的再生需要大量的毛细胞和支持细胞，所以有丝分裂细胞的分化仍然是实现毛细胞再生的最佳方式。原因在于如果所有的支持细胞都转分化为毛细胞，会导致大量支持细胞的损失，这将改变感觉器官结构的完整性。成熟哺乳动物听觉系统的支持细胞虽然处于胚胎发育的有丝分裂终末期，但它们在前庭系统仍然保持有低水平的增殖能力。到目前为止，已有实验利用生长因子、干细胞以及后选基因的方法实现了成熟哺乳动物内耳支持细胞的增殖和毛细胞的分化。

另外，一个干细胞来源就是胚胎发育期的动物。小鼠胚胎干细胞被接种至鸡胚后，会在内耳形成成熟而聚集的感觉区。此外，当胎鼠神经干细胞被移植至致聋大鼠后，一部分移植细胞会分化成神经胶质或神经细胞，而其他细胞会聚集成表达毛细胞标记物的前庭感觉上皮。然而，这些研究尚没有明确显示新生细胞是否形成了对于听觉和平衡觉的恢复所必需的神经传导通路。

对于使用干细胞仍然存在很多其他的问题。比如，正常小鼠椭圆囊支持细胞的增殖能力很低，那么如果对细胞进行分离培养，什么可以充当分子和环境信号而使它们增殖活跃？再者，在体内又能否实现干细胞的激活呢？到目前为止，已经有学者构建了大鼠椭圆囊斑上皮永生细胞系，该细胞表现有原始支持细胞的特征，可以条件性地持续增殖超过25代。在bFGF存在的情况下可以转化成毛细胞样细胞（表达早期的毛细胞特异性标记物网膜蛋白和钙调蛋白），同时，过表达Math1基因也可以诱导其变成毛细胞样细胞（毛细胞特异性抗体MyosinⅦa阳性）。这在一定程度上解决了支持细胞增殖能力低的问题，但细胞植到体内能否继续存活并在适当条件下转化为有功能的毛细胞尚是未知数。

（三）生长因子

已经有学者将生长因子单独或联合使用以确定它们是否对有丝分裂的再生具有促进作用，它们包括成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、IGF、BDNF、EGF以及TGF－α。Zheng等发现bFGF能促进表现有早期支持细胞某些特征的大鼠前庭上皮永生系细胞分化，分化的细胞表达有早期毛细胞的标志物，提示bFGF可能参与了支持细胞向毛细胞的转化。Yamashita等对成年小鼠的正常椭圆囊进行培养，向培养液中加入TGF－α、EGF（与胰岛素一起）后，可见感觉上皮细胞增殖，认为TGF－α、EGF（与胰岛素一起）与EGFR结合后，可以刺激成熟哺乳动物前庭感觉上皮的前体细胞增殖，提示在正常细胞分裂增殖过程中，有多种生长因子参与且协调起作用。陈向东等发现EGF在小鼠胚胎第13～14天的耳蜗上皮及螺旋神经节的神经细胞中有阳性表达，而此期正是小鼠胚胎内耳发生上皮增殖的时期，说明EGF参与内耳的发育过程，并且主要起促进增殖作用。但是，这些生长因子对于促进成熟哺乳动物感觉上皮的增殖具有很有限的作用。例如，通过渗透泵将转化生长因子－α、胰岛素以及有丝分裂示踪标记物胸苷注入大鼠内耳中，椭圆囊半薄切片经透射电镜可以发现胸苷标记细胞。但只有很少量的细胞可以刺激产生分化成熟的后有丝分裂毛细胞。

Heregulin是一种上皮生长因子，它可以在新生大鼠椭圆囊上皮单层细胞或经庆大霉素处理以后的组织培养物中明显促进支持细胞的增殖。此外，经庆大霉素处理的培养物的毛细胞层比未处理的对照培养物中发现了更多的胸苷示踪标记物。RT－PCR分析及免疫组化结果显示内耳感觉上皮有heregu－lin及其结合受体的表达。Heregulin也可以刺激新生小鼠椭圆囊感觉上皮培养物中支持细胞的增殖，但对成年小鼠却无此作用。因此，生长因子在成年哺乳动物前庭感觉上皮的促有丝分裂反应是完全不同于新生动物的。

（四）前体细胞

近年来，有学者发现GER和LER细胞很有可能是耳蜗毛细胞的前体细胞。Corti器是一个精密的嵌合体，由一定数目的感觉毛细胞和支持细胞以高度有序的方式排列而成。毛细胞分为内毛细胞和外毛细胞，支持细胞有数种类型，包括柱细胞、Deiters细胞（外指细胞）、Hensen细胞、Claudius细胞、内指细胞和内缘细胞。内、外柱细胞的头部相衔接，基底分开形成三角形的Corti器隧道。在隧道内侧（内柱细胞内侧）的内指细胞上有单排内毛细胞，在内指细胞和内毛细胞内侧是内缘细胞，其内侧是内螺旋沟，内螺旋沟的底部细胞有单层的立方上皮即为内沟细胞（inner sulcus　cells），来源于GER。在Corti器隧道外侧（外柱细胞外侧）的Deiters细胞（外指细胞）上有三排外毛细胞，外指细胞外侧为Hensen细胞，再外侧为Claudius细胞，Hensen细胞和Claudius细胞来源于LER。经典的组织学研究表明，在E11．5d，耳蜗上皮的前体细胞就基本形成了，随后这些细胞会增殖扩展为位于内侧的GER和位于外侧的LER。大约在E15至出生，GER和LER会逐渐分化为原始Corti器的毛细胞和支持细胞。出生后，仍可见GER和LER，只是它们会发生结构上的重排和细胞数量的减少，并逐渐分化为内螺旋沟细胞、外螺旋沟细胞（原始的Hensen细胞和Claudius细胞）以及其他的非毛细胞上皮细胞。出生后10d，GER和LER完全消失，耳蜗结构基本发育成熟。从某种程度上说，GER和LER是耳蜗不成熟的标志之一。需要指出的是：一部分学者将新生哺乳动物中位于Corti器内侧区域的细胞统称为GER，而位于Corti器外侧区域的细胞统称为LER；也有一部分学者将此两种细胞直接分别命名为内沟细胞和外沟细胞。

有研究表明当耳蜗组织培养物过表达Math1或果蝇atonal人类同源基因1（human homolog　of the　drosophila gene　atonal 1，Hath1）后，会引起GER和LER区域产生异位毛细胞；而Hes1的敲除也会导致GER 和LER区域异位毛细胞的产生，并且这些毛细胞显示有Math1表达水平的升高；而正常情况下，GER及LER会在出生后逐步转化为内沟细胞、齿间细胞以及Hensen细胞和Claudius细胞，这提示GER和LER可能是耳蜗毛细胞的前体细胞。此外，有学者利用腺病毒载体将Math1转染至成熟豚鼠耳蜗的内淋巴囊中构建Math1在耳蜗非感觉细胞的过表达模型，结果显示Math1过表达可以诱导邻近Corti器的齿间细胞、内沟细胞以及Hensen细胞区域产生新生的毛细胞样细胞，并且听觉神经轴突伸向一部分的新生毛细胞，提示新生毛细胞吸引了听觉神经元。最近又有研究发现利用贴壁和机械分离相结合的方法分离出的纯的LER细胞可以形成具有增殖能力的细胞球，在Hath1基因过表达的情况下，LER细胞可以转化为毛细胞样细胞；同时，LER细胞球与来自前庭的间质细胞共培养同样可以实现向毛细胞样细胞的转化。关于bHLH转录因子在GER表达的研究发现Hes1只在P0～3大鼠GER有表达，而Math1和Hes5在P0～5大鼠GER中均无表达。这提示可能正是由于出生后GER不表达Math1基因，才导致其在生后分化成内沟细胞，而不是继续转化成毛细胞。以上研究结果充分证明GER和LER是毛细胞的前体细胞。

综上所述，内耳毛细胞再生的现象早已在鸟类及低等脊椎动物中得到了证实，而且近年来的研究证明毛细胞再生同样可以在哺乳动物中得以实现。迄今为止，虽然有关哺乳动物内耳毛细胞发育、分化以及再生方面的机制尚不清楚，但可以肯定的是这些过程是受特异的基因和信号所控制的，同时，细胞间的相互作用也起到一定作用。另外，有学者认为毛细胞损伤后支持细胞对Math1过表达的反应能力以及由此而产生的新生毛细胞的重建能力也许有赖于致聋的机制、致聋后的治疗时机以及残存非感觉细胞的分化程度，鉴于此，更好地理解支持细胞对Math1表达的反应将有助于Corti器细胞结构损伤后的修复。另外，已证实氨基糖苷类导致的毛细胞损伤可能是由一种信号通路所调控的，并且不同的药剂已经被应用于同时提高毛细胞存活以及功能的研究中。当然，GER和LER作为毛细胞的前体细胞也将在毛细胞再生的研究中发挥重要作用，比如前体细胞永生化细胞系的建立将为毛细胞分化和再生的机制以及基因表达模式方面的研究提供无限的组织来源，也将为前体细胞移植治疗感音神经性聋奠定实验基础。但是“新生”的毛细胞是否真正具有功能，又能否与螺旋神经节细胞建立正常的突触联系都仍然是未知数。但我们有理由相信，基因治疗以及干细胞/前体细胞技术方面的研究将为感音神经性聋的治疗带来新的希望，我们终究会寻找到一种适合于临床的、安全而有效的治疗方法，从而实现真正意义上的“内耳毛细胞再生”。

（翟所强　张　媛）

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