突发性聋发病机制

突发性聋病因并不完全明了。由于其临床表现多样、预后影响因素较多、存在自愈性倾向等，其病理生理机制研究较为复杂和困难。由于内耳深埋于颞骨之中且结构微小精细，致使针对患者的在体研究极为困难，因此合适的动物模型对研究突发性聋极为重要。由于目前认为耳蜗缺血是突发性聋的主要病因，因此建立耳蜗缺血的动物模型在突发性聋的研究中占有重要的地位。

【常用动物】

耳蜗缺血动物模型常用的实验动物有豚鼠、小鼠、大鼠、兔、蒙古沙鼠等。其中因豚鼠的听力学特征与人较接近，并且其耳蜗的血管解剖与人有很大的相似性，故制作动物模型时多选用豚鼠。随着分子生物学的发展，因小鼠的基因与人类较接近，所以听觉生理较为宏观的研究逐渐更多地选用小鼠或大鼠。而蒙古沙鼠是因其Willis环后交通支缺如，有利于造成耳蜗缺血，也是常用的实验动物。

【实验技术】

耳蜗缺血动物模型的理论基础是采用不同的方法造成耳蜗缺血从而引起耳蜗功能障碍，并力求与突发性聋的临床表现一致。常用实验技术有以下几大类。

1．耳蜗血流监测方法　耳蜗位置深在，位于骨质结构包围内。要了解耳蜗微循环的变化，就需要一个既保持其结构和功能不受干扰，又能准确可靠进行观察的方法。主要方法如下。

（1）激光多普勒技术：Miller等将激光多普勒血流计探头置于人去除黏膜后的薄的骨岬处（选择鼓膜穿孔患者在中耳手术时）和豚鼠耳蜗底圈骨壁，研究人和动物的耳蜗血流（cochlear blood　flow，CBF）。此方法可在耳蜗不受损时透过骨壳测量耳蜗内血流，并连续动态观察，具有方向性强、便于控制等优点。但也有对血流变化不能精确定位和骨壳内血流、耳蜗间液体流动、呼吸等可影响准确性的缺点。

（2）活体微循环观察：在适当光照条件下，借助显微镜直接观察活体动物的血流状态，可发现微血管的收缩和舒张、血流速度及红细胞、白细胞的流动状态等，具有定位准确，信息多，可连续观察的优点。Nuttall结合荧光技术对耳蜗微循环进行了研究，使观察过程更加清晰，图像反映更准确。Hu等应用此方法在耳蜗各圈开窗，直接观察耳蜗侧壁微血管的舒缩、血液流速、红细胞流动状态等，结合计算机分析，对血液流速这一微循环参数进行研究，同时也能观察到耳蜗侧壁的放射状小动脉、血管纹血管、动静脉吻合血管、集合静脉和螺旋突血管。其缺点是观察部位少，手术可能造成微血管损伤。

（3）微球技术：将微球（生物微球、放射性微球、非放射性碳素微球等）注入左心室，微球会随血流按比例分布至全身各个器官。全身不同部位终末小动脉中滞留的微球数与该部位的循环血流成正比。通过镜下计数滞留于耳蜗各圈微血管中的微球数，即可了解微循环状况及相对血流量。优点是无损伤地测量近似于生理状态的耳蜗微循环血流量，同时还可以较为精确地测量耳蜗各圈不同区域血流量。缺点是不能连续动态观察，微球本身也对微循环生理状态产生一定影响。

2．耳蜗功能监测方法　应用电生理的方法可以对实验动物进行动态实时的功能监测。常用的有耳蜗微音器电位（cochlear microphonic potential，CM）、总和电位（summating potential，SP）、复合动作电位（compound action　potential，CAP）、畸变产物耳声发射（distortion product　otoacoustic emission，DPOAEs）、听性脑干电位（auditory brainstem response，ABR）等。可以根据实验目的及具体情况选择。

3．耳蜗组织形态学观察方法　应用耳蜗切片、耳蜗外侧壁血管纹铺片、耳蜗基底膜铺片及相关染色技术后研究耳蜗组织结构的形态学改变。了解耳蜗血管、螺旋神经节细胞和毛细胞等的损伤、坏死、凋亡及恢复的规律。同样可以根据实验目的及具体情况选择不同的指标和方法。

【动物模型】

1．光化学诱导血栓栓塞法（光化学法）

（1）造模要点：①　豚鼠麻醉后腹侧径路打开一侧听泡，去除耳蜗表面的黏骨膜同时保持鼓膜和听骨链的完整。除目标部位外，耳蜗其余部位用黑纸遮盖，②　卤素灯冷光源经滤光后形成波长为（560±10）nm的绿色光束照射目标部位。③静脉插管注射2%四碘四氯荧光素二钠（rose bengal，RB）。④耳蜗血流的监测：三维推进器将激光多普勒血流计针型探头垂直置于耳蜗外侧壁被照部位表面，信号输出至血流记录仪，记录耳蜗血流。⑤　耳蜗功能的监测：手术显微镜下安装圆窗银球电极，参考电极置于同侧颈部肌肉内，鼻尖接地，以诱发电位测试系统测试耳蜗电图中的复合动作电位（compound action potential，CAP）阈值。⑥耳蜗组织形态学的研究：耳蜗外侧壁血管纹铺片或耳蜗基底膜铺片后研究耳蜗组织结构的形态学改变。

（2）病理生理机制及应用研究：20世纪80年代开始有学者用光化学反应的方法诱导血管内血栓形成，为研究血管内血栓形成及造成损害的病理生理机制提供了一种良好的动物模型。

光化学法诱导血管内血栓形成的机制是，光敏剂（如四碘四氯荧光素二钠）会在一定波长光的作用下，发生光化学反应，生成自由基和单态氧，可与血管内皮细胞蛋白质分子的氨基酸残基、不饱和脂肪酸、DNA和RNA分子中的鸟氨酸残基发生氧化学反应使血管内皮细胞受损，细胞肿胀、破坏、通透性增加，内皮细胞抗血栓形成的功能消失，并激活血小板导致其黏附、聚集于受损内皮细胞表面和暴露的血管基膜上，并发生血小板脱颗粒反应，血管内凝血最后形成血栓，与病理状态下的内皮细胞受损和基膜暴露激活血小板致血栓形成的过程基本一致。血栓形成后可致耳蜗毛细血管萎缩、闭塞，血管纹缺血状态严重，进而导致外毛细胞、内毛细胞发生水肿、坏死。

由于光化学法诱导血栓形成与病理状态下的血栓形成过程基本一致，其机制均为血管内皮细胞受损致血栓形成；因此，在脑缺血性损伤、血管性眼病、内耳缺血性损伤及抗血栓药物等的研究中得到了广泛的应用。为进一步研究耳蜗微循环障碍引起的缺血性损伤机制和治疗开辟了新的途径。1990年开始，Umemura等首先应用光化学法建立了耳蜗缺血动物模型。通过对大鼠静脉注射光敏剂四碘四氯荧光素二钠后，以波长（560±10）nm的光照射其耳蜗、前庭或小脑下前动脉，成功诱导血栓形成，导致大鼠听力损害，前庭功能障碍，造成实验动物内耳缺血性损伤。

多项研究证明光照后可导致耳蜗血流量（CBF）下降并逐渐加重，耳蜗电位（EP）也逐渐下降，电镜显示光照后血管纹内皮细胞首先发生肿胀变形，血管内红细胞聚集，血栓形成后局部血管内皮细胞变性坏死，进而毛细胞也开始变性坏死，而未损伤部位血管纹和毛细胞完整。同时血迷路屏障通透性明显增高并随时间的延长而加重。张学渊等（1995）的研究发现光化学法引起的耳蜗Corti器缺血性损伤与内耳急性动脉性缺血的Corti器，以内毛细胞首先肿胀碎裂、继之外毛细胞崩解消失的特点相一致，而不同于内耳急性静脉回流障碍致Corti器外毛细胞首先萎缩消失的形态特点。

张学渊等（1995）、钟贞等（2003）采用光化学法成功研究了豚鼠耳蜗局部微循环障碍，与耳蜗血管分布的节段性和区域性特点相一致。为进一步研究耳蜗微循环障碍引起的缺血性损伤机制和治疗开辟了新的途径。钟贞等（2003）的研究表明在应用光化学诱导耳蜗微循环形成血栓后给予溶栓治疗可使耳蜗血流有不同程度的改善，听力损失的程度减轻，毛细胞坏死数目减少。

2．三氯化铁（FeCl3）诱导血栓栓塞法（三氯化铁法）

（1）造模要点：①手术暴露基底动脉、小脑前下动脉或迷路动脉。以小脑前下动脉为例，豚鼠麻醉后动物仰卧位固定颈前正中切口，气管切开、插管，自主呼吸。正中分离气管下组织，离断食管，钝性分离附着于颅底的肌肉组织，暴露枕部颅底。于右侧颅底用电钻磨开一约4mm2骨窗，探针刺破硬脑膜，放出脑脊液，暴露小脑前下动脉（anterior inferior cerebellarartery，AICA）。②将饱含一定浓度FeCl3溶液（40%～50%）的滤纸覆盖于动脉表面，一定时间后去掉，生理盐水冲洗局部组织。③　监测耳蜗血流。连续记录耳蜗血流变化，耳蜗血流下降到一定程度不再下降并稳定时即模型成功。④　监测耳蜗功能。⑤观察内耳形态学改变。

（2）病理生理机制及应用研究：铁离子可侵入血管壁从而造成血管内膜损伤、内皮下胶原暴露，引起血小板黏附聚集，启动内源性及外源性凝血系统，最终产生血栓。该方法形成的动脉血栓成分为纤维素、血小板、红细胞、白细胞等，为混合血栓，与机体病理状况下所形成的动脉血栓很相似，同时过程较缓慢，接近于临床自然疾病过程。

罗志强等建立基底动脉栓塞动物模型时采用结扎实验豚鼠双侧颈动脉，运用40%三氯化铁（FeCl3）溶液诱导基底动脉栓塞，采用激光多普勒流量仪测量诱导栓塞前后耳蜗血流量（CBF）的变化，以压力传感器和前置放大器等装置同步监测平均动脉压（mean artery blood　pressure，MABP）的变化。发现40%FeCl3溶液诱导5～10min，CBF开始下降，随着诱导时间的延长，CBF下降进一步加大，诱导50min时，CBF显著下降达64．5%，而MABP无明显变化。说明运用40%FeCl3溶液能诱导豚鼠基底动脉栓塞，为临床动脉栓塞所致内耳微循环障碍机制的研究及抗栓药物的开发应用提供一个理想的实验动物模型。熊巍等采用FeCl3诱导小脑前下动脉血栓形成后应用尿激酶（urokinase，UK）溶栓后，CBF可恢复至实验前水平的70%左右，提示血栓已部分溶解。为研究缺血再灌注损伤及相关药物研究提供了一个很好的方法。而且小脑前下动脉的栓塞除了影响内耳供血外，只影响一小部分小脑脑桥角，对ABR的影响较小。另外，手术暴露AICA较暴露迷路动脉的创伤小，手术难度相对较小，具有可行性。但实验中少数AICA栓塞后CBF无变化，可能是由于迷路动脉直接从基底动脉发出，应引起研究者注意。

3．血管内磁微粒定向栓塞法（磁微栓法）

（1）造模要点：①　静脉注射羰基铁微粒混悬液（直径约2μm）。生理盐水按1%比例混合，超声波清洗仪震荡，静置片刻后，抽取中上层较均匀磁微粒混悬液备用。豚鼠麻醉后切开颈左侧皮肤，分离出颈静脉并插管，缓慢注入磁微粒混悬液1ml/kg。②激光多普勒流量仪探针型探头动态测量监测耳蜗血流。③　柱形轴向钕铁硼永磁铁（直径215mm，表面磁场强度350mT）固定于左外耳道，30min后取出，以诱导磁微粒定向积聚，阻塞内耳微血管，形成内耳缺血模型。④听性脑干反应（ABR）、耳声发射（DPOAEs）监测耳蜗功能。

（2）病理生理机制及应用研究：静脉注射羰基铁微粒混悬液后外耳道置磁铁，可以诱导磁微粒定向积聚于耳蜗附近，阻塞耳蜗微血管，在耳蜗微循环平面形成内耳缺血模型。

Schweinfurth等采用直径1．7～2．5μm羰基铁微粒对家兔进行研究发现造模后10minDPOAEs下降了5～19dB，30～40min 和100～120min下降最多达到12～37dB，45～70min可反弹到造模前的70%～90%。多数动物140min恢复正常，少数在1～3周后也恢复正常。组织学检查发现耳蜗微循环有磁微粒，但无血栓形成及血管栓塞，耳蜗其他结构未发现明显变化。李洪涛等采用直径2～315μm羰基铁微粒对豚鼠进行研究发现造模后1d耳蜗微血管内出现磁微粒引起的栓塞，2d后减少，4d基本消失；纹血管红细胞数在造模后1、2d减少，4d基本恢复；造模后CBF随即平均下降至50%，维持24h，2d恢复至79%，4d恢复至99%；造模后1d模型耳听毛细胞无明显异常，而8d时外毛细胞纤毛出现散在缺失、血管纹肿胀变性。动态观察CBF及静态指标纹血管红细胞计数均显示耳蜗外侧壁血流降低，并有缺血导致的耳蜗外毛细胞的损害，而内毛细胞无明显变化，证实了模型的耳蜗缺血不同于急性动脉缺血的表现，即耳蜗结构广泛破坏及内毛细胞先受损的变化。表明磁微粒栓塞模型的病变程度及表现形式，有其自身的特点。并且其耳蜗血流呈先降低后恢复的可逆性变化过程。另外，当CBF急剧下降的24h内，耳蜗基底膜毛细胞无明显变化，而在造模后8d出现了损害，可能与缺血后再灌注损伤有关，值得探讨。实验观察了造模后1、2d豚鼠各1只的肺脏，未发现磁微粒造成肺毛细血管的非特异性栓塞。而通过调节磁场强度可避免毗邻磁场脑栓塞的形成。造模条件是安全而有效的。磁微粒栓塞成功地造成了豚鼠内耳缺血，方法简便，易于实施，CBF具有可逆性特点，可作为耳蜗缺血性疾病研究及治疗药物筛选的实验模型。

4．开颅动脉阻断法

（1）造模要点：开颅手术后压迫或夹闭基底动脉的分支小脑前下、后下动脉或迷路动脉。手术方法见前“三氯化铁法”所述。

（2）病理生理机制及应用研究：开颅动脉阻断法要经颅底开颅后暴露基底动脉及其分支，使用金属棒压迫或丝线结扎的方法阻断迷路动脉，可以造成单纯的内耳缺血，而不影响脑部其他的血液供应，松开金属棒或丝线后，即为再灌注模型。这种人工机械性的方法可以比较迅速地阻断和恢复耳蜗的血流，可用来研究急性缺血时耳蜗内血流的调节机制及病生理变化。

胡博华等用此方法研究了急性缺血时耳蜗不同部位血流的变化。根据耳蜗外侧壁血管的走向分布，一般将其分为血管纹毛细血管和螺旋韧带血管。前者是耳蜗血管纹区的主要供能血管，对维持耳蜗正常的生理功能起十分重要的作用。而后者是动－静脉吻合血管，主要起调节血管纹毛细血管血流量的作用。研究发现不同程度地阻断耳蜗供应血管后，血管纹毛细血管血流下降出现早，幅度大，表明内耳供血下降对不同的耳蜗内血管影响程度不同。这可能是由于维持毛细血管血流运动需要的灌流压高于动－静脉吻合血管所致。其生理意义在于当耳蜗供血不足时，通过维持耳蜗内部分血管血流通畅，达到维持耳蜗生理功能的目的。在耳蜗急性缺血时，尽管耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内的血流停止，但只要螺旋韧带血管内血流维持一定的水平，耳蜗生理功能即能维持在一定程度上，提示螺旋韧带血管除参与一般情况下耳蜗外侧壁血流量的调整，在耳蜗供血极度下降时，对耳蜗功能的维持起十分重要的作用。当耳蜗供应血管阻断解除后，多数动物耳蜗血流在1～2min恢复。部分动物血流不能完全恢复，或恢复一定程度后再次下降。其原因可能是缺氧造成耳蜗微血管内皮细胞损伤，当血流恢复流动后，受损的细胞出现再灌流损伤。

5．不开颅动脉阻断法

（1）造模要点：手术结扎一侧颈总动脉并阻断同侧基底动脉，或者结扎一侧颈总动脉及阻断双侧椎动脉，甚至双侧颈总动脉结扎、双侧椎动脉阻断等方法制作耳蜗缺血动物模型，均考虑到Willis环的侧支供血供能的影响。

（2）病理生理机制及应用研究：不开颅动脉阻断法由于要考虑到Willis环的侧支供血供能的影响，采用结扎一侧颈总动脉并阻断同侧基底动脉，或者结扎一侧颈总动脉及阻断双侧椎动脉，甚至双侧颈总动脉结扎、双侧椎动脉阻断等方法制作耳蜗血循环障碍动物模型，或选用Willis环不完整的蒙古沙鼠作为实验动物。此类方法简单易行，成功率高，但上述方法造成耳蜗缺血的同时，也造成椎－基底动脉及颈动脉供血区血液灌流不足，甚至全脑缺血，脑缺血、缺氧、灌流压的降低均可以引起ABR的变化，因此所测得的ABR不能特异性地反映单纯内耳缺血对ABR的影响。

【动物模型特点】

内耳血供中虽然椎－基底－迷路动脉系统与颈外动脉之间尚有吻合支，但迷路动脉仍然是内耳唯一的供血动脉。其主要来自椎基底动脉的分支小脑前下动脉，但存在解剖变异，也可来自小脑后下动脉，甚至可以来自基底或椎动脉。Adam等和汪吉宝等报道位于蜗轴中的螺旋蜗轴动脉，由耳蜗底端向蜗顶端行走中以一定的等距离反复逐次向四周呈放射状地分出3组细动脉，即外、中、内放射状动脉，分别分布于耳蜗侧壁、骨螺旋板、基底膜，以及螺旋神经节和神经纤维等处。3组动脉间无吻合支，说明耳蜗的血管分布具有明显的节段性和区域性特点，并可能有不同的病理生理学意义。从理论上分析，耳蜗不同节段的局限性微循环障碍所引起的感音性聋，应该有不同的听力学特点。

颞骨解剖观察发现，疑为缺血引起的内耳疾患中，仅少数出现典型的动脉完全阻断性内耳缺血的病理变化，推测多数内耳缺血可能为血流量一定程度的下降，随后部分或完全恢复，即呈缺血/再灌注的可逆性过程。因此，研究耳蜗的缺血/再灌注损伤比研究单纯的耳蜗缺血损伤，更符合临床实际。

【动物模型选择】

上述各种不同的耳蜗缺血动物模型由于其引起耳蜗缺血的方法不同，其病理生理机制也不尽相同，因此在应用时要根据自己的研究目的有选择地应用。

1．不开颅动脉阻断法　方法简单易行，成功率高。但由于要考虑到Willis环的侧支供血的影响，需要同时阻断多条血管。常用的有结扎一侧颈总动脉并阻断同侧基底动脉，或者结扎一侧颈总动脉及阻断双侧椎动脉，甚至双侧颈总动脉结扎、双侧椎动脉阻断等方法制作耳蜗缺血动物模型，或选用Willis环不完整的蒙古沙鼠作为实验动物。因此上述方法造成耳蜗缺血的同时，也造成椎－基底动脉及颈动脉供血区的血液灌流不足，甚至全脑缺血，而脑缺血、缺氧、灌流压的降低均可以引起ABR的变化，因此所测得的ABR不能特异性地反映单纯内耳缺血对ABR的影响。研究时应注意选择合适的监测指标。

2．开颅动脉阻断法　可以造成单纯的内耳缺血，而不影响脑部其他的血液供应，解除阻断后，即为再灌注模型。但这种人工机械性的方法使血流的阻断和恢复都比较迅速，不符合自然状态下机体的缺血/再灌注的发病过程。而且实验者所用不同规格线栓、金属棒、压迫的不同深度造成的缺血范围等也有明显差异。同时这种方法必须开颅，手术复杂，创伤大，术后豚鼠死亡率较高，不利于较长时间地观察耳蜗缺血后的听力及病理改变。开颅寻找迷路动脉难度大。阻断小脑前下动脉，内耳缺血程度及性质变异大，并可能同时引起脑干的血流降低，干扰位听神经信号的传导，影响内耳缺血效应的观察。

3．磁微粒法　可在微循环水平阻断内耳血流。由于脑、肺及内耳的毛细血管直径不同，限制磁微粒的直径可避免造成肺毛细血管的非特异性栓塞。通过调节磁场强度可避免发生毗邻部位脑栓塞。造模条件是安全而有效的。方法简便，易于实施。重要的是CBF具有可逆性特点，可在2h至3周内自行恢复，与某些突发性聋的临床表现类似。而且对动物的全身生理功能几乎没有干扰，可长期观察。

4．三氯化铁法　在血管上诱导血栓形成的方法，过程缓慢，符合机体自然疾病过程。血管外包裹用药的操作简单，栓塞部位准确，重复性好。该方法形成的动脉血栓与机体病理状况下所形成的动脉血栓很相似，接近于临床。但采用FeCl3诱导小脑前下动脉（AICA）或迷路动脉形成血栓的方法，需要开颅，且豚鼠小脑前下动脉细小，最大直径不超过0．5mm，肉眼几乎难以辨认，必须借助手术显微镜才能在其表面进行操作，具有一定操作难度。

5．光化学法　简单易行，可重复性、稳定性好。应用广泛，可在耳蜗、前庭或小脑下前动脉等不同部位诱导血栓形成，可通过控制光照强度、时间、光敏剂浓度，定点、定量地形成血管内血栓。诱导耳蜗局部血栓时不用开颅，手术创伤小，对血管损伤小，对颅脑其他部位及全身影响较小。血栓产生机制与人类血管血栓形成过程相似。可在微循环水平阻断血流，不受动物个体血管解剖变异的影响，准确反映了内耳外周感受器的缺血效应，可研究耳蜗局部区域缺血性损伤引起的微循环障碍。

对于内耳缺血再灌注的研究，目前报道急性试验仍占主导地位，虽然使我们对内耳的生理有了深入的了解，但其与临床疾病的病情过程并不一致。因此动物实验结果与临床结果也不完全一样。如动物实验表明钙拮抗药等多种药物对毛细胞具有保护和促进恢复的作用，而临床实际应用治疗突发性耳聋、耳鸣的效果并不理想。还需要进一步的研究。

（余力生　夏瑞明）

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