外侧耳蜗橄榄束对内毛细胞下突触复合体的调控

虽然目前研究耳蜗外毛细胞能动性及其耳蜗放大机制已成热门，然而有解剖学依据表明，耳蜗95%以上的信息传入是靠耳蜗内毛细胞（IHC）及其下的突触复合体来完成。内毛细胞下突触复合体受到来自中枢的外侧橄榄耳蜗系统（lateral olivocochlear　complex，LOC）的调节，所以耳蜗传入神经并不是单个信息一对一的传入。因此，耳蜗传入通路中这一环节的研究也将成为人们越来越关注的课题。近年来随着实验方法的改进和不断探索，人们对它的认识正逐渐加深。

（一）IHC下突触复合体的结构

内毛细胞突触复合体（the inner　hair cell synaptic complex）由内毛细胞和听神经树突的突触小结构成的传入突触和由传出神经末梢与听神经树突的突触小结构成的传出突触两部分组成（图15－3）。内毛细胞与所有的Ⅰ型螺旋神经节细胞形成突触并组成放射状传入神经纤维进入脑干的蜗核，同时起源于同侧上橄榄复合体（superior olivary　complex，SOC）外侧的小神经元对内毛细胞与Ⅰ型螺旋神经节细胞形成的传入突触进行反馈调节（见书末彩图15－4）。

图15－3　内毛细胞的神经传导

内毛细胞与传入神经直接形成突触连接（左a）；传出神经末梢与听神经树突的突触小结构成传出突触（左e）；右外毛细胞与传出神经（右e）和传入神经（右a）直接形成突触连接

（二）耳蜗传出神经的结构及LOC的调控作用

在传入突触传递过程中，内毛细胞下突触复合体的另一部分－传出突触对其起着重要的调控作用。传出突触主要通过外侧橄榄耳蜗束向突触复合体内释放神经递质来发挥作用。

1．耳蜗传出神经的结构　耳蜗传出神经系统的中枢位于脑干上橄榄核复合体附近的神经元群，向下发出传出神经对听觉信号的传入进行反馈调节，即形成橄榄耳蜗束（olivocochlear bundle，OCB）。根据神经元群的形态和位置及它们调节毛细胞情况的不同，耳蜗传出神经系统可分为两大类。

（1）外侧橄榄耳蜗系统：外侧橄榄耳蜗复合体（lateral olivocochlear　complex，LOC）神经元约占OCB神经纤维总体数量的54%，起源自外侧上橄榄复合体（lateral superior olivary complex，LOS），其神经纤维较细，无髓鞘包裹。大部分（约90%）与同侧的内毛细胞下耳蜗传入神经元树突形成突触连接。

（2）内侧橄榄耳蜗系统：内侧橄榄耳蜗复合体（medial olivocochlear　complex，MOC）神经元约占OCB神经纤维总体数量的40%，起源于上橄榄复合体的内侧核，其神经纤维较粗，有髓鞘包裹。大部分交叉到对侧与Corti器的外毛细胞直接形成突触连接。

2．LOC的调控作用

（1）LOC的调控作用：主要是通过向突触复合体间隙内释放神经递质来实现的。目前在内毛细胞下突触复合体的传出突触中已发现的神经递质或调质主要有：乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、γ－氨基丁酸（GABA）多巴胺（dopamine DA）、降钙素相关肽（calcitonin gene－related peptide，CGRP）和脑啡肽（Enkephalin）等。对MOC系统生理的研究报道较多，但对LOC系统的功能知之甚少。其原因主要是很难对LOC系统进行有选择性的刺激或破坏。有关LOC系统的资料主要来自于对包括LOC和MOC系统在内的整个耳蜗传出神经系统的破坏的研究。但是对这些来自损伤实验的结果必须谨慎解释，因为实验者很难在第Ⅳ脑室底部或者内耳道分别对LOC或MOC进行准确破坏。橄榄耳蜗束在Corti器的分布很分散，而且即使有残留很少的神经纤维就可以保持其正常的功能，这也就是很多损伤实验在破坏传出神经后观察不到任何有意义的变化的原因。

为了解决这些技术上的限制，有研究者将刺激电极放在下丘处来间接地刺激LOC系统并观察动物耳蜗内的反应。但更多的研究者采用向活体动物耳蜗内灌注神经递质相关药物的方法来进行研究。如上所述，LOC系统释放多种神经递质和神经调质，其中大部分在MOC系统同样有分布，而仅多巴胺只存在于LOC系统内。因此，现在的很多研究主要利用多巴胺来研究LOC系统的调控作用。多巴胺的作用基本上能够代表整个外侧橄榄耳蜗束的功能。研究表明，多巴胺在谷氨酸的神经传递中有重要的调节作用，并且在LOC系统的生理和病理中占有重要地位。多巴胺对听觉传入神经的树突有着紧张性的抑制作用，当发生缺氧或噪声损害时，在突触间隙内谷氨酸会过量释放产生兴奋性毒性，而多巴胺通过抑制传入突触后膜对谷氨酸过量刺激的反应，提高反应阈值，从而起到保护作用。所以，可以认为LOC系统具有调控耳蜗传入信号和保护作用。

（2）多巴胺的分布：研究证明，外侧上橄榄体（lateral complex　of superior　olive，LSO）中存在多巴胺能神经元，而LSO是LOC神经元的起源神经核，Mulders等以豚鼠为研究对象，用形态学的方法证明了LSO中的多巴胺能神经元同样是外侧橄榄耳蜗束神经元总体中的一部分。应用两种形态学方法：①向耳蜗内注射荧光逆行性示踪剂，乙酰胆碱转移酶，因为它参与合成乙酰胆碱，而外侧橄榄耳蜗束的神经元是乙酰胆碱能的，所以被这种方法染色的神经元可认为是外侧橄榄耳蜗束的神经元；②对酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）进行免疫荧光染色，而TH是多巴胺的特异性标记物，所以被这种方法染色的神经元可认为是多巴胺能神经元。当向耳蜗内注射示踪剂后，研究发现绝大部分TH标记的神经元中同样包含着这种示踪剂。这样就证明了LSO中的多巴胺能的神经元确实是外侧橄榄耳蜗束总体神经元的一部分。同时研究还发现多巴胺能神经元在LSO中并不是均一分布的，而是集中分布在LSO中部的高频区域。耳蜗的切片显示高密度的示踪剂主要分布在耳蜗的基底圈和第2圈，而越向顶圈染色的密度越低，TH的分布同样如此。这些研究都表明LOC中的多巴胺能神经元可能在对听觉系统中高频纤维的选择性抑制中起作用。

为了保持听神经元对声音刺激反应的生理特性，需要有效的机制来清除LOC传出神经释放的多巴胺。有学者最近研究证明多巴胺转运体（Dopamine transporter，DAT）定位于LOC传出神经纤维上。向外淋巴液中灌流选择性的DAT抑制药诺米芬辛和哌啶可以抑制自发性或声音诱导的听神经活动，同时增加了细胞外多巴胺的量。

（3）多巴胺的功能：已经有很多学者对多巴胺的功能进行了研究。研究表明多巴胺在谷氨酸的神经传递中有重要调节作用，并且在LOC系统的生理和病理中占有重要地位。以前的研究表明，声音刺激与多巴胺的循环和代谢以及外侧传出神经中的酪氨酸羟化酶有剂量依赖性的关系。现在有足够的证据表明听觉传入神经的树突受到外侧传出神经的紧张性调控。多巴胺参与调节听神经的活动并对伤害性刺激具有保护作用。当发生缺氧或噪声损害时，在突触间隙内谷氨酸会过量释放产生兴奋性毒性，而多巴胺通过抑制传入突触后膜对谷氨酸过量刺激的反应，提高反应阈值，从而起到保护作用。

Ruel等通过向正常豚鼠耳蜗内灌流多巴胺和多巴胺拮抗药，然后分别记录其复合动作电位和单个神经纤维的动作电位，以此来研究多巴胺对传入神经活性的调节。发现当向耳蜗内灌注多巴胺时，听神经的CAP会呈现一种剂量依赖性的幅度降低，阈值升高，N1波的潜伏期延长。而代表外毛细胞功能的耳蜗微音电位和代表血管纹功能状态的蜗内电位（Endocochlear potential，EP）都无有意义的变化。这表明多巴胺是在突触后膜水平即传入神经树突末梢上起作用的。多巴胺在不改变单个神经纤维频率调谐特性的情况下可使其自发性和诱发性放电活动减弱。总之，现有研究表明多巴胺是一种抑制性LOC神经递质，对自然声音刺激下的神经反应起着调控作用。但是，在研究中发现多巴胺的拮抗药（SCH－23390和依替必利）同样可使CAP的幅度降低。研究者对少量的听神经纤维（n＝13）进行了测量，在其中一部分神经纤维中，拮抗药可以增加听神经的基本活性，提高听阈的敏感性，使CAP的幅度升高，而在另外一些神经纤维中，一开始听神经放电率增加但紧接着迅速地降到用药前以下的水平，CAP的幅度降低。这可能是由于多巴胺的紧张性抑制去除后神经的放电率突然增加，但紧接着会发生谷氨酸兴奋性中毒的早期症状，又会使放电率下降。在对灌注了依替必利的耳蜗进行超微结构的观察中发现，一些传入神经的树突发生了肿胀，这提示听神经放电率的明显降低可能是谷氨酸兴奋性中毒的早期征兆。这些结果都表明多巴胺可能对听神经的活性具有紧张性抑制作用，去除这种紧张性抑制作用可能导致谷氨酸兴奋性中毒早期症状的出现。但是，这并不意味着整个LOC系统的功能是抑制性的，在LOC系统中与多巴胺并存的还有乙酰胆碱等多种神经递质。Felix等的研究为LOC系统的兴奋性作用提供了支持。他们在内毛细胞－传入突触附近应用了乙酰胆碱，结果使神经自发性放电率增加。LOC系统中其他神经递质的单独作用或协同作用还有待进一步的实验研究来证实。

目前比较公认多巴胺首先是一种抑制性神经递质，而且只存在外侧橄榄耳蜗束中，对自然声音刺激下的神经反应有紧张性抑制作用。Mulders等通过对耳蜗切片进行免疫组化染色显示多巴胺在耳蜗中的分布并不是均匀的。底圈较多，越往顶圈越少。

侯志强等行全耳蜗灌流多巴胺发现，随着灌流多巴胺浓度的逐渐加大，灌流后各频率刺激声引出的CAP阈移也逐渐增加，呈现明显的量效依赖关系，说明多巴胺确实对耳蜗传入通路有抑制性作用，且有频选择性，频率越高，CAP阈值越大，与多巴胺分布特点一致。

（4）多巴胺的作用机制：研究表明在耳蜗中共有五种亚型（D1、D2、D3、D4和D5）的多巴胺能受体，这五种亚型的受体都在螺旋神经节细胞上有分布。根据其同源性可分为D1和D2受体家族，D1受体家族包括D1和D5受体，D2受体家族包括D2、D3、D4受体。多巴胺D1受体主要定位在螺旋神经节的神经元上和内毛细胞下的神经纤维上。而多巴胺D2受体的定位目前还不确定，据推测主要定位在外侧传出神经末梢上。

Elmar等应用微离子电渗法对多巴胺及其D1、D2受体的生理作用进行了研究。研究发现当单独应用多巴胺的时候，对传入神经的自发性放电多巴胺基本上不起作用。相反的，对由谷氨酸NMDA和AMPA受体介导的传入神经的放电，多巴胺却有一种剂量依赖性的抑制作用。当应用多巴胺D1或D2受体激动剂时，也会产生类似的效应。多巴胺的这种抑制作用可被多巴胺D1或D2受体拮抗药所阻断。由此表明多巴胺对传入神经放电性的抑制作用可以通过多巴胺D1或D2两种受体亚型来介导。

Ruel等的研究表明D2受体拮抗药会导致CAP幅度的下降并会诱导神经的肿胀。另一研究表明，在强噪声暴露下的耳蜗中会产生由兴奋性中毒诱导的树突肿胀，应用D2受体激动剂会对抗这种反应而对耳蜗产生保护作用。现在已经确认多巴胺D1和D2受体家族具有相反的作用。在噪声情况下，D2受体占主导并起到增强抑制的作用，而在正常声音条件下D1受体占主导并起增强兴奋的作用。以前的生理学研究也表明LOC系统会起到抑制或增强的双重作用。有学者通过广泛的研究证实，多巴胺释放的调节主要与突触前膜上的D1受体有关，而D2受体并不影响多巴胺的释放。

最近Niu X等对多巴胺的作用机制进行了探讨，并发现了一条以多巴胺D1受体为主要中介的作用途径。具体作用机制如图15－5所示。

图15－5　多巴胺通过多巴胺D1受体途径的作用机制

cAMP：环磷腺苷；PKA：磷酸激酶A；GluR1：谷氨酸受体1；DARPP－32：谷氨酸和环磷腺苷调节磷蛋白；PP－1：蛋白磷酸酶。图中实线箭头代表正性效应，虚线箭头代表着负性效应

图15－4中示多巴胺首先与多巴胺D1受体结合，然后通过cAMP激活磷酸激酶A （PKA），PKA被激活后可以使GluR　1磷酸化增加，GluR　1磷酸化之后作用增强，从而使听神经的活性增强，听神经的复合动作电位（CAP）幅度增加。这里还有一个负性调节机制，如图15－4所示，PKA可以使DARPP－32磷酸化而被激活，激活的DARPP－32对PP－1具有抑制作用，而PP－1对GluR　1具有激活作用，这样就间接地抑制了GluR　1的活性。当然，耳蜗中可能还存在着多巴胺的其他作用途径，但这一研究结果为我们进一步理解听觉神经系统的生理和多巴胺D1受体及其相关信号传导途径如何在听觉功能中发挥作用提供了重要基础。

为了进一步证明多巴胺作用程序中Glu的作用，侯志强对正常豚鼠耳蜗组织液分别灌流人工外淋巴液，灌流10mmol/L、30mmol/L及50mmol/L多巴胺进行RTPCR及其产物电泳，观察其扩增片段位置并与Marker BM2000的各条带位置进行比较，可以看到各组豚鼠耳蜗中均有NMDANR　1 和NMDANR　2A的mRNA的表达。但多巴胺对传入神经抑制作用的机制是通过减少Glu受体起作用的。

通过检测NMDA NR1和NR2受体mRNA的吸光度值，与正常耳蜗对照相比，人工外淋巴液组的差异没有统计学意义（P ＞0．05）；而灌流多巴胺组随浓度增加，NR1受体减少，且10mmol/L，30mmol/L，50mmol/L各多巴胺组的差异均具有统计学意义（P＜0．05）。而NMDANR2A受体mRNA的吸光度值各实验组间均没有统计学意义（P＞0．05）。提示：多巴胺的抑制作用机制主要与Glu受体NMDA NR1减少有关，NMDA NR1的量与多巴胺的浓度呈明显的浓度－剂量关系。NMDA NR2A不参与抑制作用。

（三）进一步探讨的问题

1．LOC的传出突触分布与兴奋性的关系　研究表明，听觉传入神经在没有明显刺激的情况下仍然会有动作电位的产生，这被称为神经的自发性活动。根据神经纤维自发性放电率的不同，听觉传入神经纤维可分为高、中、低三类。而自发性放电率不同的神经纤维其反应阈值也不同，高自发性活动纤维的反应阈值最低，低自发性活动纤维的反应阈值最高。听觉传入神经纤维的阈值分布范围很广，这种分布特点是听觉传入神经实现强度编码的重要机制之一。研究还发现切断传出神经后，听神经传入神经纤维的自发性放电率显著降低，提示传出纤维对传入神经具有一定的兴奋作用。而LOC的传出突触在各个传入神经纤维的分布不同，这可能是导致兴奋性不同的原因，但还有待进一步研究。

2．听觉传入神经纤维放电率与LOC的调节作用　听觉传入神经纤维放电率在一定范围内随声强增加而呈非线性变化。当刺激强度低于阈值强度时，神经纤维放电率（自发性活动）会有所下降。当刺激强度略高于阈值时，放电率的增加很小，低于刺激强度增加的速度。随着刺激强度继续增加，在一定声强范围内，放电率迅速增加，而后放电率的增加逐渐减慢，直至饱和，继续增加声强不再提高放电率。听觉传入神经纤维放电率的这种非线性变化很可能与LOC的调节作用有关，值得深入探讨。

3．听觉适应与多巴胺的关系　在声音刺激后听神经的放电率迅速达到最大值，紧接着有一个逐步的减退，这叫做听觉适应。听觉适应有一个很宽的时间窗，从几毫秒到几秒。从功能上讲，听觉适应增强了听神经对快速强度变化过渡的能力，这在言语和音乐的感知过程中起着重要作用。而LOC系统释放的多巴胺很可能在这个过程中起重要作用。

4．IHC下突触复合体在耳蜗传入信息编码中的作用　LOC与耳蜗强度编码，螺旋神经节神经元第1个动作电位发放时间与声音强度呈现很好的对应关系，即随声音强度增强，发放时间逐渐变短，而且发放时间表征声音强度的关系比动作电位发放速率稳定、规则。而LOC很可能参与这种现象的调节。

根据内毛细胞下突触复合体的特殊结构和听神经的发病特点，有学者提出内毛细胞下突触复合体可能具有言语编码功能。如前所述，耳蜗每个内毛细胞有10～30个活动区，每个活动区只与一条传入神经纤维的突触小结形成突触连接。如果把一个内毛细胞视为一个神经元且与10～30根传入纤维相接，实际上形成了“放射状”结构，这种放射状结构即反馈调节初步网络结构与听皮质中枢的听放射及网状结构相似，而这些结构对言语的时间整合及相位编码等起重要作用。因此，可以推测在耳蜗信息传入部位就开始对言语进行编码和初级的识别。

实验证明，小鼠耳蜗底圈IHC的25个活动区中的每一个可以以最快2　000囊泡/s的速率快速在突触前膜释放递质。这么高的突触前膜融合速率显然可以满足听神经上最高频率的冲动发放。这些在快速相释放的突触囊泡组成了快速释放池（readily releasable poal，RRP）。另有研究表明不仅内毛细胞Ca2＋通道是毛细胞频率调谐过程所必需的前提，而且某些毛细胞仅对某一频率范围的声刺激产生反应而表现出电位共振，这种电位共振依赖于L型Ca2＋通道与Ca2＋激活的K＋通道。这些IHC及突触前膜的“RRP”和钙通道的特点为耳蜗的频率分析机制之一排放理论提供了重要的依据，而频率分析又是言语识别的基础。

Moser等在突触前膜记录到反映RRP耗竭的IHC出胞速率减慢的现象，其时程相似，且RRP恢复时程的两个阶段与听神经复合动作电位从适应中恢复的时程也相似。因此，突触前膜的RRP的耗竭现象可能在听觉快适应中起重要作用。正如在前文中叙述的那样，同侧橄榄耳蜗束的抑制性传出神经递质多巴胺的作用，可能是快速听觉适应的基础。

IHC拥有功能不同的活动区，它们分别与具有不同自主频率和阈值的听神经纤维形成连接，而活动区之间不同的释放特性可解释听神经纤维间自主频率的变化。已观察到功能不同的活动区RRP恢复动力学是有差异的。也就是说耳蜗毛细胞与听皮质相似也有空间分布特点，即位置编码作用，这也是耳蜗进行言语编码的基础之一。

根据临床观察表明，听神经病患者言语识别率下降程度与其纯音听力下降不成比例。我们推测在耳蜗信息传入部分就开始对言语进行编码（包括言语时间、空间和强度编码）。听神经病患者除了由于同步化减弱听觉中枢的言语编码障碍之外，外周耳蜗传入部分可能也出现言语编码障碍，二者之累积作用就可能导致言语识别的严重下降。而LOC系统对耳蜗传入突触又起着重要的调控作用，那么在耳蜗水平的言语编码中是否也有作用呢？值得进一步深入探讨。

综上所述，IHC下突触复合体除了具有频率分析功能，如同听中枢一样，可能还存在较为复杂的言语时间、空间和强度编码的功能。但这些都需要进一步的探讨和实验证明。