差异蛋白质的鉴定

（一）实验目的与主要原理

在通过荧光差异显示-双向电泳分析后，通常会得到一些差异蛋白质点，这些蛋白质点需要经过鉴定，才能知道其具体名称，而后才能分析其功能。由于荧光差异显示-双向电泳胶上的蛋白质点量非常小，不适合进行鉴定，因此往往需要通过使用制备胶（500～1000μg的蛋白质上样量），进行差异蛋白质的鉴定

（二）实验材料

考马斯亮蓝R250，胰蛋白酶，DTT，碘乙酰胺。

（三）实验步骤

1.准备500～1000μg的蛋白质，进行双向电泳，具体方法同前。

2.电泳结束后，进行考马斯亮蓝染色，具体程序如下：

（1）将胶放入固定液中（20%乙醇，7%乙酸）室温，1h。

（2）加入染色液（plastgel blue RR350），4h。

（3）用脱色液进行脱色（5%乙酸，20%乙醇），30min至1h。

（4）加入去离子水，清洗。

3.为了增加分辨率，可以在考马斯亮蓝染色的基础上，进行银染。

（1）固定加入固定液（25ml乙酸，100ml乙醇，125mlH2O），室温1h，200ml（以充分浸透为准）。

（2）加入敏化液（75ml乙醇，0.75g硫代硫酸钠，17g醋酸钠），室温1h。

（3）漂洗于H2O漂洗，5×8min。

（4）加入银染液（0.625g硝酸银，H2O250ml，使用前加入100μl的甲醛），室温1h。

（5）加入显色液（碳酸钠6.25g，H2O250ml，使用前加入250μl甲醛），5min。

（6）加入终止液（EDTA.2Na7.3g，250mlH2O）。

4.将染色好的胶扫描成图，与荧光差异显示-双向电泳进行比对，找到差异蛋白质点位置，然后在制备胶上切取这些蛋白质点，准备酶解。

5.酶解

（1）加入50μlddH2O，洗两次，10min/次，吸掉。

（2）加入100mmol/L硫代硫酸钠/30mmol/L铁氰化钾（1∶1）的混合物50μl，超声脱色5min，吸干。

（3）20mmol/L碳酸氢铵洗，直至胶粒透明。

（4）加入乙腈50μl，至胶粒完全变白，真空抽干5min。

（5）加入10mmol/LDTT20μl，56℃1h。

（6）快速吸干，加入55mmol/L碘乙酰胺（IAM）20μl，避光，45min。

（7）依次用25mmol/L碳酸氢铵、50%乙腈、100%乙腈脱水，至胶粒完全变白，真空抽干5min。

（8）加入0.1μg的胰蛋白酶（用20μl25mmol/L碳酸氢铵稀释），4℃30min，后再加入15μl25mmol/L碳酸氢铵，37℃，消化过夜。

（9）加入2%三氯乙酸，终止反应。

6.将酶解产物进行MALDI-TOF-MS分析，确定差异蛋白质的成分和名称。

（1）取1μl酶解产物，与1μl基质（10mg/mlCHCA），混合点样后，上样于板上，待基质挥发结晶后，利用MALDI-TOF-MS进行肽指纹谱分析。检测条件：脉冲氮激光（337nm）作为离子解析电离源，加速电压20kV，采用反射分析模式，分子量分析范围700～3000（m/z）。

（2）PMF数据检索：将MALDI-TOF-MS获取的数据输入到MASCOT检索引擎，在NCBI的大鼠蛋白质数据库中进行检索，检索条件：胰蛋白酶遗漏酶切位点设为2，固定修饰设定为半胱氨酸的胺甲酰化修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，搜索时分子量偏差200ppm，显著性水平P<0.05。

（四）注意事项

1.银染时，应该选用超纯水以减低背景。

2.在酶解过程中，避免样本外的蛋白质污染。

（五）主要问题及解决方法

为什么用MALDI-TOF无法鉴定出蛋白质点的成分？

答：在排除了仪器的问题和操作问题外后，这种现象可能与所鉴定蛋白质点中蛋白质含量太低或者是蛋白质混合物所致（MALDI-TOF只能鉴定单一的蛋白质成分）。解决方法：提高双向电泳的蛋白质上样量；如果是蛋白质混合物，则需要用其他方法如液质联用技术进行分析。

（六）结果示例

肾小球2-D DIGE图及FHL2蛋白质的鉴定（图2-19）。

图2-19　大鼠肾小球2-DDIGE电泳图谱及FHL2的鉴定

A.标记了Cy2、Cy3和Cy5肾小球蛋白质的双向电泳图谱；B.FHL2蛋白质的肽指纹谱；C.MASCOT鉴定FHL2的结果