双脱氧测序法

双脱氧测序法由原来采用同位素标记、四泳道电泳、手工读序的方法，发展到目前的四色荧光、单泳道电泳、自动化分析序列的技术。在此简单介绍一下四色荧光的测序技术原理。

双脱氧测序主要利用了生物DNA复制基本原理。DNA的复制需要DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。DNA在复制的过程中，聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键；如果在反应液中加入一定浓度的4种ddNTP （ddATP、ddGTP、ddTTP和ddCTP），且每种不同的ddNTP带有不同的荧光标记，经过反应后，即可形成一系列只差1个碱基的DNA片段产物混合物，且产物的3'末端为单一ddNTP残基。将产物经变性聚丙烯酰胺凝胶（可以将差1个碱基的DNA片段分离开）电泳，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD（charge-coupled device）摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光根据先后顺序转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

测序反应基本流程如下。

一、样品的制备

高质量的DNA样品是测序成功的重要保证。目前测序样品主要是质粒和PCR产物，对于样品的质和量有一定的要求：PCR产物需要进行纯化，去除PCR反应中残留的引物、dNTP等。质粒的纯化目前均以试剂盒完成，具体可参考前述。所得的纯化产物最好用去离子水溶解，尽管应用TE可以获得更多的产物。其原因是其中的EDTA会对测序反应中的DNA聚合酶具有一定的抑制作用。

1．纯度检测

（1）紫外分光光度法检测：A260/A280在1.6～1.9。

（2）电泳检测：PCR产物为单一条带；质粒应符合质粒常见带型。

2．质量检测 A260测定浓度要达10ng/μl以上，否则浓度测定不准，而且也会影响测序反应体系。

二、测序反应

ABI所提供的测序反应体系总体积大多为20μl，在实际操作中，常进行倍比减少体积，但模板和引物的用量比例不变，多以5μl或10μl的反应体积为主，也可以达到良好的测序效果。在这里介绍10μl反应体系。

【材料】

（1）BigDye测序反应试剂盒：主要试剂是BigDye mix。

（2）DNA模板。

（3）测序引物：10μmol/L。

（4）测序缓冲液：5×。

（5）灭菌去离子水。

（6）仪器：PCR仪。

【操作步骤】

（1）在0.2mlPCR反应管中加入表10-1所列试剂，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

表10-1 0.2ml PCR反应管中应加入的试剂

*左侧为经验用量，为了获得更好的结果，对于模板的用量常根据模板的长度进行估计，每1 000bp应用60～90ng

（2）将PCR管置于PCR仪上进行扩增。在选用PCR仪器时，注意仪器参数设置尽可能地与ABI9600等仪器的设置一致或差别不大，尤其注意其升、降温速度（表10-2）。

表10-2 PCR仪参数设置

三、反应产物的纯化

上述产物中含有未反应的荧光标记的ddNTP，它们的存在将会影响起始序列确定，局部序列不能进行分辨，所以在上机检测时，应进行纯化处理。

纯化的方法，AB公司推荐的有3种，分别是乙醇/EDTA/醋酸钠沉淀法、乙醇/ EDTA沉淀法和柱式离心纯化法。在这里介绍乙醇/EDTA/醋酸钠沉淀法的基本过程。

【材料】

（1）测序PCR产物。

（2）125mmol/L EDTA（pH 8.0）。

（3）3mol/L NaAC（pH 6）。

（4）70%乙醇、无水乙醇。

（5）模板抑制试剂（TSR）：ABI公司。

（6）仪器：台式（冷冻）高速离心机。

【操作步骤】

四、上机检测

ABI公司的测序仪有ABI310、3100、3130、377、3700、3730等型号，根据各自说明进行设置运行。

五、结果分析

DNA序列分析是获得正确序列的关键步骤，一般分为以下两个方面。

1．查看原始电泳图（raw electropherogram） 好的测序结果。在出现测序峰后。同种信号峰的高度大致相当，然后呈现逐渐降低的趋势，不应出现急速骤降现象；信号峰与峰之间距离大致相等，不应出现变宽现象（图10-1）。此部分结果一般在ABI公司提供的sequencing analysis可以看到，发给客户的chromas软件无此功能。

分析软件自动识别首个峰，但时有出错，如果raw electropherogram图形较好，而结果不对，有可能在测序信号首峰没有正确确定，导致序列截短。

2．查看electropherogram 应用chromas软件查看序列，对于结果的评价应从以下几个方面入手分析。

（1）各信号峰高度基本相等，尤其是3730等仪器，运用了信号补偿技术，即使长片段测序，首尾信号峰高度保持大体相当。

（2）信号峰与峰之间的距离（space）大多是一致的。

（3）信号峰是单一的，无噪声信号（即杂信号）；SNP检测时会出现两个或多个信号峰。

（4）符合上述信号峰条件的序列长度在650bp以上。目前ABI测序仪一个测序反应都可以达到此要求，对于50cm的毛细管可以达到正确碱基数1 100以上。

图10-2为一个测序反应较好的结果。

图10-1 一个测序结果的原始电泳图（见彩图）

图10-2 一个测序反应较好的结果（见彩图）

3．测序的序列质量查看 上述对于序列的查看只是一个大致的序列分析，对于序列分析中各碱基的正确程度，可以利用ABI公司提供的sequencing analysis软件进行分析，运用此分析是衡量一个测序质量重要参考标准。

每个碱基的Quality value （QV）应用下列公式进行计算：

QV=–10Lg Pe（Pe 表示为错误的概率）

如果Pe=0.01，则QV=20；Pe=0.001，则QV=30，依此类推，其实该公式反应了碱基的正确程度。常用设置，QV<15，为红色； QV>20，为蓝色；介于其中为黄色，如图10-3所示。在序列中，Bar的长短与QV值的大小成正比。

图10-3 QV值的大小与Bar的对应关系（见彩图）

图10-4为上述测序反应（图10-2）的QV情况，QV>20的碱基数量达650bp以上，并且是连续的。

图10-4 测序反应的QV情况（见彩图）

六、常见问题分析

见表10-3。

表10-3 双脱氧测序法常见问题分析