焦磷酸测序

焦磷酸测序（pyrosequening）是一种以等位基因特异性引物延伸为基础的新兴的基因分型方法（图2-1）。这一实时测序技术包含一套4酶级联反应，并会产生强度与掺入核苷酸数目成正比的荧光信号。

图2-1 焦磷酸测序原理示意图

焦磷酸测序反应使用前先要进行靶序列PCR扩增。在检测前，PCR产物还必须通过纯化步骤，去除游离核苷酸和多余的PCR引物，避免它们对后续反应产生干扰。一般情况下，对一对PCR扩增引物中的一条在其5′末端进行生物素标记，使其在纯化过程结合到链霉素包被的琼脂糖珠或磁珠上，被固定后的PCR扩增产物就能与可溶性的其他PCR体系成分分离而被纯化，并通过变性而获得单链DNA（ssDNA）。无论是固化的生物素标记的DNA链还是和洗脱了的DNA链均可用于焦磷酸测序。

在焦磷酸测序反应中，ssDNA模板与短的测序引物退火，再与DNA聚合酶，三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）硫酸腺苷基转移酶、荧光素酶（luciferase）、三磷腺苷双磷酸酶（apyrase）、腺苷5′-磷酰硫酸（adenosine 5′ phosphosulfate，APS）和萤光素（luciferin）共孵育。4种三磷脱氧核苷（deoxynucleotide triphosphates，dNTPs）按照预先设定顺序被依次添加。如果添加的某种dNTPs与模板链上的碱基是互补的，在DNA聚合酶的催化作用下，该脱氧核苷酸就掺入到合成的新DNA链中，同时释放一个焦磷酸基团。这个新释放的焦磷酸基团在ATP硫酸腺苷基转移酶作用下参与形成ATP。随后，荧光素酶利用前述生成的ATP，介导荧光素转换成为氧化荧光素。这一反应过程产生可以被检测到的化学发光，并且光信号强度与掺入的脱氧核苷酸数目成正比。过剩的dNTPs和ATP将在三磷腺苷双磷酸酶催化下降解。如果添加的某种dNTPs不与DNA模板链上的碱基互补，那么它就不会掺入到新合成的DNA链中，也就不会有荧光信号产生。

目前焦磷酸测序仪器主要利用24孔板、96孔板和384孔板格式，每天可分析5 000～50 000个SNPs。这一技术具有精度高、引物定位有一定灵活性，以及在10min内能实时测定50多个bp（base pair）等优点。此外，它不需要电泳和片段分离。在测序模式下，可以提供少量邻近的碱基序列信息。因此，这种方法的一个主要优点是一定程度上能对DNA模板中小的插入与缺失，以及新多态性位点进行检测。

这种方法的主要缺点是样本纯化过程制备比较耗费时间，一种利用酶解方法的样本纯化方案，不再使用生物素标记引物以及固相载体，直接使用双链DNA作为模板，从而简化了焦磷酸测序前的模板纯化步骤，降低了成本，提高了样本纯化的自动化程度。最新的技术利用Blocking PCR Primers技术使双链模板准备步骤一步完成。焦磷酸测序方法还面临一些的其他缺陷，例如难以确定5个以上相同脱氧核苷酸掺入时的确切数目，因为这种情况下已经超出了光反应的线性范围等。