焦磷酸测序（pyrosequencing）是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。该方法是由Nyren等人于1987年建立，由Biotage公司发展起来的一种新型的酶联级测序技术。2003年，Biotage公司将焦磷酸测序技术的大规模并行形式授权给454生命科学公司（现为Roche子公司）用于产品开发，454生命科学公司于2005年研制出Genome Sequencer 20 系统，在高通量基因组测序中发挥重要的作用。该项技术除了在基因组大规模测序中应用外，在高通量SNP检测、表观遗传学研究、分子诊断以及遗传和病原体检测的多重分析等方面都显示出强大的发展前景。在这一部分将简单介绍其测序的基本原理。
焦磷酸测序其本质与双脱氧测序一样，都是利用了DNA复制的基本原理；但双脱氧测序法不同的是，利用了DNA合成过程中释放出的焦磷酸，激活一系列的酶联反应，将新加入的核苷酸转换为荧光信号而测定的方法。基本的反应过程如下：
1．PCR制备测序反应模板 此反应与常规的PCR反应相同，但不同地方在于PCR引物中一条引物5'端进行生物素标记。
2．制备测序反应单链模板 单链的分离策略：将生物素化的PCR产物与含有链亲合素蛋白的磁珠结合，经过变性后，采用磁力分离单链产物，作为测序反应的单链模板。原理如图10-10所示。
图10-10 制备测序反应单链模板的原理
3．测序反应
（1）引物与模板退火、配对。
（2）测序循环反应（图10-11）
①向反应体系中循环（4种dNTP核苷酸，构成一个循环）、依次（一个循环按A、C、G、T依次加入）加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶（DNA polymerase）的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
②在ATP 硫酸化酶（sulfurylase）的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶（Luciferase）的催化下，生成的ATP又可以和荧光素（Luciferin）结合形成氧化荧光素（oxyluciferin），同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则与相匹配的碱基数成正比。
③反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶（Apyrase）的作用下发生降解。
④加入另一种dNTP，使第①～③步反应重复进行。
图10-11 焦磷酸测序循环反应的过程（见彩图）
4．序列分析 根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
（张 宝）
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