基于纳米孔的单分子测序技术

在第二代测序技术平台中，DNA测序模板阵列的制备依赖于PCR扩增，这不仅在测序模板的扩增拷贝过程中容易引入复制错误，而且PCR扩增存在明显的偏向性，这对于有效地获得全基因组测序模板阵列形成了重要的技术瓶颈。

为了进一步解决上述的问题，国内外的一些科学家正在研究直接对单拷贝的DNA分子进行测序的方法，形成单分子测序技术，即第三代测序技术。单分子测序技术有可能实现更长的阅读长度，并且避免了对模板分子的扩增。单分子测序技术还有一些优点，如试剂的消耗量大大下降、只需要少量的模板等。

在单分子测序技术中，基于纳米孔的单分子读取技术吸引了科学家们的眼球。由于其不需要对DNA进行标记，也就无需使用昂贵的荧光试剂和CCD照相机，有望大大降低测序成本，成为廉价的测序技术。英国牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)开发的这种技术以共价修饰了环糊精的α-溶血素作为纳米孔碱基传感器，见图6-6，当单个碱基进入孔中，瞬间与环糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基A、T、G、C以及甲基胞嘧啶都有其特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列信息。

2009年3月份，来自美国加州太平洋生物科学公司(Pacific BioSciences)的科学家乔纳斯·考尔拉赫(Jonas Korlach)、斯蒂芬·特纳(Stephen Turner)及其研究小组在Science杂志上发表论文称，他们将纳米技术与芯片技术相结合，发明了一种新型实时DNA测序方法，速度是现有技术的30 000倍。

图6-6　共价修饰了环糊精的α-溶血素构成纳米孔碱基传感器

他们在一个蚀刻有纳米结构的微阵列芯片上放置了数以千计的零模式波导(zero-mode waveguide，ZMW)。这是一种微型、中空的金属管纳米结构，直径大约20nm，仅能容下1×(10-21)L的体积。一个DNA分子外加一个DNA多聚酶分子便可将管内空间占满。这些ZMW结构构成了一个个小孔，每一个单独的聚合酶分子都以特定的方向被固定在这些细小的孔内，这样就非常容易借助适当浓度的荧光标记核苷酸对它们进行成像观察，而且成像的背景噪声非常低。

鉴于传统的核苷酸标记方法通常都可能影响DNA聚合酶的活性而导致聚合反应提前终止，因此Korlach和Turner就开发出一种新型核苷酸标记方法，在核苷酸的末位磷酸基上进行标记，即用4种荧光基团分别修饰到4种dNTPs磷酸化部分的末端。一旦核苷酸被掺入新生链中，标记基团就会自动脱落。

在测序仪中，每一个ZMW纳米孔内都含有一个聚合酶分子，都能依照模板(即待测序序列)合成一条完整的互补链。由于每掺入一个荧光标记的核苷酸分子都会发出一次短暂的荧光信号，这些荧光信号会被仪器记录下来。这样，每一个ZMW小孔内的整个反应过程都会被特殊设计的多重共聚焦成像系统(multiplexed confocal imaging instrument)实时监控并记录下来，如图6-7。

图6-7　单分子实时DNA测序原理
单个DNA聚合酶分子被固定在一个ZMW纳米小孔中，当荧光标记的核苷酸分子与聚合酶分子结合时，荧光基团就会脱落，从而发出一次荧光信号

这样一来，仅在一块小小的芯片上，就能同时进行数千个测序反应。尤其可贵的是，在这种零模式波导纳米结构中进行测序反应时，干扰会显著减少，也就是说可以大幅提高精确度。基于这种纳米技术和芯片技术的测序仪能以2～4个碱基/秒的测序速度对环状或线状模板进行实时的精确测序。更引人注目的是，Turner等开发的这款测序仪比目前市场上的其他测序仪测序的片段长度都要长，达到了4 000个碱基。

太平洋生物科学公司打算2010年向市场推出每个芯片修饰有3 000个波导管级别的商品化产品。据公司创始人Turner预计，到2013年将能够实现在每张芯片放置100万个波导管的技术。届时进行人类基因组全序列测序仅需0.5h，而精确度达到99.999%，整个测序费用低于1 000美元的目标。

这种惊人的测序速度意味着DNA测序技术将跟随计算机技术和通信技术成为第三个“摩尔化”的学科/产业——每十几个月，性能提高1倍，价格降低1／2。这意味着在未来5～10年，一个大学的标准分子生物学实验室就能够独立完成一次人类基因组计划；15～20年，在发达国家的车库里，大学本科没上完的创业者就可以完成一次个人基因测序；30年左右，给自己基因组进行DNA测序，将是高中生生物学家庭作业之一。

目前，通过各家公司和科学家们的努力，第二代测序技术正在向着“1万美元基因图谱”前进。相信不久的将来，随着第三代测序技术的发展，人类基因组测序的费用将会降到1000美元。