-片段测序以及野生刺葡萄的鉴定

2.2.1　psbA-trnH序列PCR扩增产物测序

将野生刺葡萄cpDNA的psbA-trnH序列PCR扩增产物进行基因测序。测序结果如下：

＞Vitis davidii Foox

TCTCTAGATCTAGCTGCTGTTGAGCTCCATCTATAAATGGATAAGATTTCCGTCTTAGT GTTTACGAGTTTTTGAATGTAAAGGAGCAATAACCAATTTCCTCTTTTATCAAGGGGGATG GTATTGCTCCTTTATTTAGTAGTCTTTTATTTATCTTAGTAGTCTTTTACTTTTCTAAGTTTTT TTATTT CTTTATTT CAA CTAAAACTAAAATAGTAATAAAAAGTATT C TCATAGGTT G GTTTAT GATT GA GTAT CATACTTT GGTTTT GTT GTTTAATACCTTAAT CTTAAAGTAAGATAATAAAA AAACATGATGAATGGTGGAAATTTAATCTTTTTCAATTTGTTATTTCTTGTAATGTGAATAGT AGAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGATTTGTGAATCCACCATGCGCGA

2.2.2　基于psbA-trnH序列的系统发育分析

在获得野生刺葡萄测序结果后，用Blast搜索程序从GenBank/EMBL/DDBJ等公共数据库中调出相似性较高的相关物种的psbA-trnH序列。通过使用Mega4软件采用邻接法（ Neighbor-Joining）进行聚类分析和构建基于psbA-trnH基因序列的野生刺葡萄及其系统发育关系密切物种系统进化树，重复取样1000次进行自展值（bootstrap value）分析以评估系统进化树的拓扑结构稳定性。其结果如图4所示。

图4　基于Vitis davidii Foex及其系统发育关系密切物种psbA-trnH基因序列的系统发育树

每节上的数字为重复1000次采样分析的自展值（＞50%）。标尺为每10000个核苷酸有2个核苷酸置换。

从图4可以看出，整个系统进化树在进化关系上分为二大进化分支。Vitis davidii Foox与Vitis vinifera cv.Shaba， Vitis vinifera cv.Aligote， Vitis vinifera cv.Mtsv.Mesk， Vitis vinifera cv.Tallian， Vitis vinifera cv.Alphonse Lavallee、 Vitis vinifera cv.Chass-elas和Vitis vinifera cv.Chenin聚于同一进化分支。其中Vitis davidii Foox与这些种的相似序列同源性都为100%。Vitis vinifera cv.Melon与Vitis vinifera cv.Meunier，Vitis vinifera cv.Pirgebuli和Vitis vinifera cv.Mourvedre聚于同一进化分支。他们的相似序列同源性为99%。

由系统进化分析可以初步鉴定，Vitis davidii Foex与欧亚种葡萄（Vitis vinifera）有较高的亲缘关系。